基因工程的主要操作原理课件.ppt

基因工程的主要操作原理
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基因工程基础操作
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第一节 DNA提取
（一）总DNA 提取
大肠杆菌总DNA提取
植物总DNA提取
动物总DNA提取
质粒DNA提取
噬菌体DNA提取
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基因工程基础操作
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DNA 应用:
构建基因组文库: 100kb
Southern杂交(包含RFLP): 50kb
PCR分离基因等: 50kb
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基因工程基础操作
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因“材”施提
依据不一样研究需要, 确保结构 对应完整性
尽可能排除其它大分子成份 污染(蛋白质、多糖及RNA等)
确保提取样品中不含对酶有抑制作用 有机溶剂及高浓度 金属离子
在DNA提取过程中应做到
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基因工程基础操作
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机械裂解
化学裂解: 溶菌酶 or EDTA or both, SDS
去蛋白: 酚/***仿抽提
浓缩: 乙醇, 加单价阳离子, 如Na+
储存: -20℃放置
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基因工程基础操作
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基因工程基础操作
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操作步骤
100 mL 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。
mL TE悬浮沉淀, 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。
mL 5mol/L NaCl, 混匀。
mL CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。
用等体积酚:***仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至洁净离心管。
用等体积***仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至洁净管中。
加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟, 沉淀DNA。
用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保留。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。
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基因工程基础操作
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总标准:
取材
液氮研磨
裂解
去蛋白和细胞物
浓缩
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基因工程基础操作
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（1）CTAB法
CTAB(cetyltriethylammoniumbromide) (十六烷基三乙基溴化铵)
一个去污剂, 可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物, 该复合物在高盐溶液中( mol/L NaCl)是可溶 , mol/L NaCl时, 从溶液中沉淀。
高盐提取---低盐沉淀---高盐溶解---乙醇沉淀
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基因工程基础操作
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经典 CTAB法使用两种缓冲液
高盐提取缓冲液: 1％（冷冻干燥材料）或2％CTAB（新鲜材料）、 mol/ mol/L NaCl
沉淀缓冲液: 1％CTAB, 不含Nacl
CTAB法 优点
能很好地去除糖类杂质对于含糖较高 材料可优先使用
在提取前能同时得到高质量 DNA及RNA。可依据需要分别进行纯化, 如只需要DNA, 则可用RNase（核糖核酸酶）水解掉RNA。