氨基转换作用.ppt

实验六氨基转换作用目的要求: 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用学****应用纸层析法鉴定氨基转换反应 1实验原理体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转换酶的作用下,移换至α-***酸的过程,称氨基转换作用。 2转氨酶(aminotransferase) ?转换酶中的一类。催化氨基酸和 a-***酸或醛酸之间的氨基转换反应,生成与原来的 a-***酸或醛酸相应的 a-氨基酸或ω- 氨基酸,原来氨基酸转变成相应的***酸。转氨酶催化的反应都是可逆的。 3 ?转氨酶参与氨基酸的分解和合成,是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”; ?以谷丙转氨酶( GPT )和谷草转氨酶( GOT )最为重要。? GPT 主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中,在肝脏中活力最大。 GPT 升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标。 4 本实验是将谷氨酸与***酸在肌肉糜中谷氨酸-***酸氨基转换酶(简称谷-丙转氨酶)的作用下进行氨基转化反应,然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。 5 谷丙转氨酶 L-谷氨酸***酸α-***戊二酸 L-丙氨酸 61 在反应体系中添加溴乙酸以抑制谷氨酸和***酸的其他代谢过程。?谷氨酸、***酸(***酸羧化酶系)--糖异生途径?谷氨酸、草酰乙酸在谷草转氨酶( GOT )催化转氨基生成天冬氨酸。?***酸:***酸脱氢酶系催化生成乙酰辅酶 A,进入 TCA 循环。 7 试剂和器材试剂 1%谷氨酸溶液(用 1% KOH 调到中性); 1%***酸钠溶液(用 1% KOH 调到中性); % KHCO3 溶液; %溴醋酸溶液(用 1% KOH 调到中性); 2% Hac 溶液; % 标准谷氨酸; % 标准丙氨酸。展开剂: 酚饱和水溶液: 2份酚加 1份水混合放入分液漏斗,振荡。静置 24小时显色剂: % 茚三***正丁醇溶液。材料肌肉糜:取兔子肌肉 1g,置研钵中,加 % ***化钠溶液3ml,在低温下研磨成细浆,离心 5分钟( 3000 转/ 分),弃去沉淀,得肌肉糜提取液。 8操作方法?一、转氨酶作用 1、取试管 2只编号( 1、2),向每个试管各加 mL 1% 谷氨酸溶液, 1% ***酸钠溶液, % KHCO3 和 mL % 溴醋酸, 混匀。然后分别加入肌肉糜提取液 ml ,混匀, 将其中一试管立即在沸水浴中加热 2-3 分钟做对照。用试管帽塞住另一只试管,置于 45 ℃水浴中保温 40 min 。 2. 保温完毕,取出试管。向每只试管中各加 2% HAc 溶液 4滴, 再置于沸水浴中 2 min ,使蛋白质完全沉淀。过滤收集滤液待用。 9 二、层析验证 1. 取9厘米培养皿一个,加入酚饱和水溶液约 cm 高, 取圆形滤纸一张,在中心剪一直径约 2mm 的小孔,并以圆心约 1 cm 为半径划一圆作为底线。在此底线上,用铅笔点四个等距离的原点并标明 1,2,3,4; 2. 用毛细管分别吸取以上两种滤液及标准谷氨酸、丙氨酸,依次点在标明号码的原点处,点样 2-3 次。注意斑点不能太大,一般直径约 cm 为宜。 3. 另取一条滤纸卷成实心筒状,直径约 2~3 mm, 将此小筒插入滤纸中心小孔(不可突出纸面之上), 使层析滤纸通过此小筒与酚溶液相连。然后将滤纸平放在盛饱和酚的培养皿上。另取一大小相同的培养皿盖在滤纸上,此时酚溶液即由滤纸中心孔向四周扩散。 10