Cas9介导的水牛奶相关基因的多位点基因打靶.pdf

学校代码：10564 学号：2013202418
分类号： 密级：
硕 士 学 位 论 文
Cas9 介导的水牛奶相关基因的多位点基因
打靶
王星
张细权 教授
指 导 教 师：
唐冬生 教授
学 院 名 称： 动物科学学院
专 业 名 称： 动物遗传育种与繁殖
答辩委员会主席： 聂庆华 教授
中国·广州
2016 年 6 月
华南农业大学
学位论文原创性声明
本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研
究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包
含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重
要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声
明的法律结果由本人承担。
作者签名：日期：
学位论文提交同意书
本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关
规定，达到学位授予要求，同意提交。
导师签名：日期：
学科带头人签名：日期：
摘 要
水牛奶营养价值高，富含钙，能值高，奶品质好。中国水牛的数量资源极其丰富，
但水牛奶业的起步较晚，并且奶业的地域发展不平衡，因此，开发水牛奶业具有重大
意义。而牛乳中含量丰富的的αs1-酪蛋白在人乳中并不存在，同时也是人摄入牛奶时
重要的过敏原。本研究选取与αs1-酪蛋白表达密切相关的 CSN1S1 基因和与产奶量密
切相关的 DGAT1 基因，通过多位点基因打靶技术结合 Cas9 体外人工内切酶对在水牛
胎儿肾脏成纤维细胞对 CSN1S1 基因和 DGAT1 基因进行靶向操作。
首先，由公司针对 CSN1S1 基因的 CDS 序列设计三个 RNAi 靶位点，分别构建
shRNA 瞬 时 表 达 质 粒 pGPU6-shRNA-NEO-1 ， pGPU6-shRNA-NEO-2 ，
pGPU6-shRNA-NEO-3 和阴性对照 pGPU6-shRNA-NEO–NC。然后通过 EGFP 真核
表达载体 pEGFP-N1 和 pEGFP-C2 融合 CSN1S1 基因，构建质粒 pEGFP-N1-CSN1S1
和 pEGFP-C2-CSN1S1。将 shRNA 瞬时表达质粒和绿色荧光融合表达质粒共转染 293T
细胞，电子显微镜下观察绿色荧光的表达情况。结果表明，三组 shRNA 瞬时表达质粒
均可有效抑制绿色荧光的表达，其中 pGPU6-shRNA-NEO-2，pGPU6-shRNA-NEO-3
的效果要稍好于 pGPU6-shRNA-NEO-1。后提取转染后细胞的总 RNA，经过逆转录后
用 CSN1S1 基因特异引物做半定量 PCR，进行灰度分析，结果也同时证明了三个靶点
均有效，但三组 shRNA 表达质粒对 CSN1S1 的干扰效果没有显著差异。
然后，选择 shRNA 瞬时表达质粒 pGPU6-shRNA-NEO-2，pGPU6-shRNA-NEO
-3 质粒作为模板，设计引物并扩增 U6-shRNA-NEO 片段，将其克隆到打靶载体骨架 P
UC19-HRD