PCR技术克隆目的基因全过程.doc

实验：目基因克隆（PCR技术）
【课前预****br/>PCR (polymerase chain reaction) 反映基本原理。
【目规定】
1．学****和掌握 PCR 反映基本原理与实验技术办法。
2．认真完毕每一步实验操作，详细记录实验现象和成果并加以分析和总结。
【基本原理】
类似于 DNA 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反映环节构成：①模板 DNA变性：模板 DNA 经加热至93℃左右一定期间后，使模板 DNA双链或经 PCR 扩增形成双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反映作准备；②模板 DNA 与引物退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA 单链互补序列配对结合；③引物延伸：DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶作用下，以dNTP为反映原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新与模板 DNA 链互补半保存复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多“半保存复制链”，并且这种新链又可成为下次循环模板。每完毕一种循环需 2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板拷贝。
【实验用品】
1．材料：重组质粒DNA作为模板
2．器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化 PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机
3．试剂：
① 10×PCR 反映缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在 25℃下，，％ Triton X-100。
② MgCl2 ：25mmol/L。
③ 4 种 dNTP 混合物:每种 。
④ Taq DNA聚合酶 5U/μl。
⑤ T4 DNA连接酶及连接缓冲液：
【办法环节】
（一）PCR反映
1. 依次混匀下列试剂 35μl H2 O 5μl 10×PCR反映缓冲液 4μl 25mmol/L MgCl2 4μl 4种dNTP 上游引物（引物１） 下游引物（引物２） 模板DNA(约1ng) 混匀后离心5秒。
2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（），混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反映混合物上。
3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温10分钟，使反映产物扩增充分。
4 电泳 按前所述,取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反映产物及长度。
[注意]
1. PCR非常敏捷，操作应尽量在无菌操作台中进行。
2. 吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。
3. 加试剂前，应短促离心10秒钟，然后再打开管盖，以防手套污染试剂及管壁上试剂污染吸头侧面。
4. 应设含除模板DNA所有其他成分负对照。
【实验成果】
【注意事项】
微量操作、PCR 反映体系设计、引物设计、扩增条件优化
【思考题 】
1. 减少退火温度对反映有何影响？
2. 延长变性时间对反映有何影响？
3. 循环次数与否越多越好？为什么？
4. PCR有哪些用途？举例阐明。
附：PCR知识(供参照)
（一）PCR 反映体系与反映条件
原则 PCR 反映体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L
引物 各 10～100pmol
模板DNA ～2ug
Taq DNA聚合酶
Mg2+
加双或三蒸水至 100ul
PCR 反映五要素： 参加 PCR 反映物质重要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+
引物： 引物是 PCR 特异性反映核心，PCR 产物特异性取决于引物与模板DNA互补限度。理 论上，只要懂得任何一段模板 DNA序列，就能按其设计互补寡核苷酸链做引物，运用 PCR 就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循如下原则：
① 引物长度： 15-30bp，惯用为20bp左右。
② 引物扩增跨度： 以 200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 片段。
③ 引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易浮现非特异条带。ATGC最