PCR技术及习题.doc

PCR技术及****题
PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反映
1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA合成方向是从子链5'端自3'端延伸。事实上就是在体外模仿细胞内DNA复制过程。DNA复制需要引物，其重要因素是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、PCR反映过程是：变性→复性→延伸
类似于DNA天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反映环节构成：
①模板DNA变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，以便它与引物结合，为下轮反映作准备；
②模板DNA与引物退火（复性）：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；
③引物延伸：72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
3、成果：上述三步反映完毕后，一种DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数增多，DNA分子就以2n形式增长。PCR反映过程都是在PCR扩增仪中完毕。
4、细胞被DNA复制与PCR技术比较：
细胞内DNA复制
体外DNA扩增（PCR）
不同点
解旋
在解旋酶作用下边解旋边复制
80～100℃高温解旋，双链完全分开
酶
DNA解旋酶、DNA聚合酶
TaqDNA聚合酶
引物
RNA
DNA、RNA
温度
体内温和条件
高温
相似点
①需提供DNA模板
②四种脱氧核苷酸为原料
③子链延伸方向都是从5'端到3'端
知识点拨：
1、DNA分子复制人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋构造，称为复性。
复制条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。
2、PCR含义是多聚酶链式反映。
3、PCR技术反映条件：
①稳定缓冲溶液环境（普通使用Tris-Cl缓冲液，原则为10mmol/L,~）；②DNA模板；③合成引物（2个）；④四种脱氧核甘酸；⑤DNA聚合酶；⑥温控设备
4、PCR技术最突出长处是迅速、高效、灵活、易于操作。
5、TaqDNA聚合酶特点是：耐高温。
知识拓展：
1、DNA聚合酶不可以从头合成DNA，只能从DNA3'端开始延伸DNA链，因而DNA复制需要引物。
2、引物：引物是PCR特异性反映核心，PCR 产物特异性取决于引物与模板DNA互补限度。理论上，只要懂得任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补寡核苷酸链做引物，运用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
3、PCR引物设计原则：
（1）PCR引物普通长15-25碱基，其中G＋C约占50%。
（2）引物之间不能互配形成双链构造，引物内部也不能形成发夹构造。
（3）引物3’末端必要与目片段完全相配。
（4）引物5’末端可以不与目片段互补，可以包括内切酶位点或启动子序列，但在下一轮反映中，这些序列