细胞工程动物细胞培养细节复习题.doc

动物细胞原代培养-技术细节
1、原代培养：从机体取出后及时培养细胞为原代细胞。借助这种办法可以观测细胞分裂繁殖、细胞接触抑制、以及细胞衰老，死亡等生命现象。
2、传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上培养瓶中继续培养，称为传代培养。
3、无菌操作基本技术：
，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作台面，并启动无菌操作台电扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
，且虽然培养基相似亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一种细胞株之操作。
，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其他实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。
% ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面中央无菌区域，勿在边沿非无菌区域操作。
，避免导致污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选取恰当级别之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药物，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。
： ①CO2 钢瓶CO2 压力②CO2 培养箱CO2 浓度、温度、及水盘与否有污染
(水盘水用无菌水，每周更换)。 ③无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
4、培养基
液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃ 水槽中温热。
液体培养基(加血清) 存储期为半年，期间谷氨酰***也许会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量谷氨酰***。
(注意)： 细胞培养基普通须添加10 % 血清、pH - 。粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调节pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，由于***离子对细胞生长也许有影响，且贮存时培养基pH 易发生变化。纯水配制。 mm 无菌过滤膜过滤灭菌。标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。须作生长实验与污染测试。
5、抗生素
. 细胞库之细胞培养基不加抗生素
. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。
. 培养自其他实验室引进之细胞株，须添加抗生素，待token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。
. 寄送活细胞时，须将培养液布满整个培养瓶时，则须添加抗生素(青霉素100 units/ml + 链霉素100 ug/ml)。
. 若要检测支原体，则培养基内不可添加庆大霉素，因庆大霉素会抑制支原体生长。
6、血清：-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，普通以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿导致气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度变化太大，容易导致蛋白质凝结而发生沈淀。
7. 血清之沈淀物
. 凝絮物：发生之因素有许各种，但普遍之因素是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 导致，这些凝絮沈淀物不会影响血清自身之品质。
“小黑点”：普通通过热解决血清，沉淀物形成会明显增多。有些沉淀物在显微镜下观测像是“小黑点”，普通而言，此小黑点应不会影响细胞生长。
8、细胞冷冻保存注意事项：
. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。
. 冷冻前检测细胞与否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试与否有抗体之产生。
. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级级别，无菌且无色以5~10 ml 小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。甘油亦应为试剂级级别，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在启动后一年内使用，因