qPCR操作步骤.doc

具体的操作步骤是, RNA 提取, 随机引物反转录, 反转录产物 10 倍稀释, real-time PCR. 这个是标准的两步法。一步法是把反转录和扩增联合起来做,不推荐使用。具体的注意事项有 1:高质量的 RNA 获取, 这里的高质量不是强调 RNA 降解,而是强调 RNA 的纯度, 不能含有基因组 DNA, 以及其他杂质污染。基因组 DNA 的存在会导致定量偏高,给你错误的结果,所以一般用于定量 PCR 的 RNA 必须使用 DNase 处理,消除 DNA 污染。而 RNA 中的杂质的污染会限制 real-time PCR 的反应,导致扩增失败,给你假阴性的结果。 RNA 的降解不是关键,一个是因为定量 PCR 的引物扩增目的长度本身很短, 150-250 个 bp ,并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因,所以 RNA 降解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解,所有的 RNA 以同样的速度降解,而相对比率不会改变。 2:减少加样误差,在使用 SYBR Green MIX 的时候,一定要先按照反应的量(比如 8个孔)把所有的试剂一次性配成 MIX 然后分装,留出 5微升的反应体系给模板,为什么要使用 5微升,是因为只有 5微升以上,加样枪的误差才会比较小,如果你仅仅是吸取一微升的话,手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差,严重影响你的定量精确度。 3。选择合适的内参基因,一般用于定量 PCR 的内参基因有好几种, 但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞,比如不同组织来源,或者是动物等等,内参基因会有差异,最好的办法是,在你的样品上先测试内参基因,找到变化最小,最稳定的一个。 4。合适的引物设计,避免出现引物二聚体,非特异性扩增等等 Q- PCR 实验流程一、①实验前准备, 每天早上到实验室后, 先把超净工作台的紫外灯打开 15-20 分钟。②超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/ 一次性薄膜手套, RNA 抽提需带口罩。③取 EP 管/ 枪头时需用镊子, 不可以用使用过的手套直接取用。取完 EP 管/ 枪头后, 袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外, 实验操作过程中不得带出超净台, 移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用 75% 乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总 RNA 抽提 1) 细胞培养皿中细胞样品用 1*PB S 洗两次后,用 1m l 枪将 PB S 吸干净,加入 1ml Trizol ( invitrogen ) 溶液, 吹打混匀, 并吸至 RNase free EP 管中使细胞充分裂解, 室温静置 5min; 组织样品用液氮充分研磨, 加入 1ml Trizol (Invitro gen ) 溶液, 混匀, 室温放置 5min 使其充分裂解;( 管盖与管壁都需标记样品名称) 2) 加入 200 μl ***仿, 剧烈振荡混匀 30s , 使水相和有机相充分接触, 室温静置 3-5min;( 离心时离心管按顺序排放,离心完毕,离心管的顺序也按顺序排好,与第一步的顺序一致) 3)4℃下, 14,000g 离心 15min ,可见分为三层, RNA 在上层水相,移至另一个新的 RNase free EP 管;(用 20-