共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理讲义资料.pptx

共聚焦激光扫描荧光显微镜
什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？
共聚焦激光扫描荧光显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ）
 以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统
共聚焦系统
 细胞CT
荧光和荧光显微镜
一、荧光的基础术语
荧光物质：
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素
激发光(EXCITATION)：
能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)
488nm 520nm
异硫***酸荧光素(FITC)
发射光(EMISSION):
发射光谱；发射波峰(最大发射波长)
荧光探针：
能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）
自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):
组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。
漂白(BLEACH)：
荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 — 漂白。
荧光显微镜的不足:
,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的同时采集及共定位。
，造成实际分辨率的大大下降。
。
,完成3D的工作。
,灵敏度—荧光强度不够。

。
。
。
。
共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置
Laser
and electronic
Control Unit
激光光源及
控制装置
Computer
计算机
Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置
Microscope荧光显微镜
Anti-vibration table
防震台
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System

Nikon的 Eclipse C1 Plus
Nikon的 Eclipse C1 Plus
（ 60x ，100x）， NA = .。这是当前数值孔径最高的油浸物镜
：用电脑控制针孔的大小，可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。
Lapse: 可以在拍摄过程中不同的时间段采用不同的时间间隔。

一、基本组成
（一）激光器:多线氩离子(458 nm, 488 nm, 514 nm) 、氦氖绿(543nm)、氦氖红(633 nm)
（二）扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器)
（三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采集各种荧光信号。
（四）计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像的优化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。

（ 8μm）

、连续光学切片

（分辨由光源波长，物镜参数和针孔直径等决定，如60X， μm，。）
（细菌细胞1-2 μm，原核生物细胞1-10 μm）
优点