原代神经细胞培养方法辩析.docx

1
神经细胞培养
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主
要优点是:（1）分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点,而
且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。（2）能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免
疫组化和电生理等手段进行研究。（3）易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如
神经营养因子）等实验条件,观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。（4）便于从细胞和
分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、
发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取
得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:

主要用于神经生长因子（NGF等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1．材料和方法
（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12d的鸡蛋,用70%酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气
室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置
灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧
排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料
培养瓶中，在DMEM6血清培养液中培养。
2．结果
鸡胚背根神经节在含神经生长因子（NGF,，20ng/ml）的无血清培养液中培养24h,
神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24h,未见神经突起生长。
二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养
背根神经节（DRG细胞起源于神经性NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外
原性NGFt归刺激DRGffl胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF
存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRGffl胞，进
行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。
．材料和方法
取新生一天的大鼠（wistar种）和小鼠（昆明种）。用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤,
然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧
一半椎骨,暴露脊髓和神经节,用解剖镊分离出神经节。鸡胚背根神经节的取材方法同前。剥
除神经节被膜,%胰蛋白酶消化（37℃30min）分散后用种植（Plating）培养液稀释成
，接种于涂有鼠尾胶的35mmi料培养皿中，每皿2ml细
胞悬液置。置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲
养（Feeding）培养液培