实验七革兰氏染色法.docx

实验七革兰氏染色法.docx实验四 革兰氏染色法
一、目的要求
了解革兰氏染色的原理，学****并掌握革兰氏染色的方法。
二、基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医师 Gram创立的。革兰氏染色法（ Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类： 染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G+表示；染色反应呈红色 （复染颜色） 的称为革兰氏阴性细菌，
G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应， 是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。 革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状
结构组成的， 在染色过程中， 当用乙醇处理时， 由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫 - 碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而
脂类物质含量高，当用乙醇处理时， 脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫 - 碘复合物易被乙醇抽出而脱色， 然后又被染上了复染液 （番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（ basic dye ）初染液；媒染剂（ mordant）；脱色剂（ decolorising agent ）和复染液
counterstain ）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（ crystal violet ）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力， 即以
某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（ iodine ）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色， 不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用 95％的酒精（ ethanol ）。复染液也是一种碱性染料， 其颜色不同于初染液， 复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色， 而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色， 从而将细胞区分成 G+和 G- 两大类群，常用的复染液是番红。
三、器材
大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；
革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。
四、操作步骤
1．涂片将培养 14—16 小时的枯草芽孢杆菌和培养 24 小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰 1—2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2．染色
（1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
（3）脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用 95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约 20— 30 秒钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染 用番红液染 1—2 分钟，水洗。
（5）镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准， 过于密集的细菌， 常常呈假阳性。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度， 如脱色过度，则阳性菌可被误染