《Hela细胞传代培养》.ppt

《Hela细胞传代培养》
培 养 板
常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、
流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
清洁液的配制
HeLa 是Henrietta La4 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种
1悬浮生长细胞传代
离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。
直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
（Hela细胞）
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。

采用酶消化法传代。％的胰蛋白酶液。
2 细胞培养用液的配制
D-Hanks原液试剂配方
***化钠 磷酸氢二钠（Na HPO ·2H O） ***化钾 磷酸二氢钾 三蒸水 1000ml
D-Hanks工作液试剂配方
D-Hanks原液 100ml 三蒸水 896ml % 酚红液 4ml
D-Hanks工作液试剂配方
D-Hanks原液 100ml 三蒸水 896ml % 酚红液 4ml
消化液：
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+％ 。用滤器过滤除菌。
胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。
天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限。
成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。
易发生支原体污染
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定。
成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）
②多种金属离子
③激素；
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。
⑤各种生长因子
⑥转移蛋白
⑦不明成分
一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清．
对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．
血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。
在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．
无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。
无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。
1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。
无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。
向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。
无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。
目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清
血清质量好坏是实验成败的关键。
常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。
优质血清的标准