基因工程制药培训.pptx

概述
目的基因的获得
基因的表达
基因工程菌的培养
基因工程药物的分离纯化
传统制药（生化制药）存在的问题:
；
；
，使用受限制。
，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
反转录酶
合成cDNA
替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
多聚核苷酸激酶
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
目的基因的获得
一、反转录法
二、反转录PCR
三、化学合成法
常用的方法:
一、反转录法
为了克隆编码某种特异蛋白质
多肽的DNA序列，可以从产生该蛋
白质的真核细胞中提取mRNA, 以
其为模板，在反转录酶的作用下，
反转录生成该蛋白质mRNA互补
DNA（cDNA第一链），再以cDNA
第一链为模板，在DNA聚合酶Ⅰ作
用下，最终合成编码该多肽的双链
DNA序列。
cDNA克隆示意图
DNA聚合酶I
mRNA
反转录酶
ss-DNA
ds-cDNA
ds-cDNA
核酸酶S1
二、反转录PCR
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模
板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA
第一链，直接以其为模板（不需要合成cDNA第二链）进行PCR扩增，获得目的基因，用于重组、克隆。
三、化学合成法
前提：核苷酸序列已知；或已知其蛋白质的氨基酸序列，再推导出核苷酸序列
限制性：
1）不能直接合成太长的基因；
2）遗传密码的简并性可导致中性突变；
3）成本较高
DNA合成仪
基因的克隆与表达
基因表达：基因在生物体中的转录、翻译及所有加工过程。
基因高效表达：外源基因在某种宿主细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，重组到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。
基因表达研究的主要问题：目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。
建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键
一、宿主菌的选择
宿主菌应满足以下要求：
具有高浓度、高产量、高产率；
能利用易得廉价原料；
不致病、不产生内***；
发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；
容易进行代谢调控；
方便重组DNA操作；
产物容易提取纯化。

（1）大肠杆菌
表达产物的形式：细胞内不溶性表达(包涵体)、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少数情况下也可分泌到细胞外。不同的表达形式具有不同的表达水平及完全不同的杂质。
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，遗传背景清楚（共4405 ORF）
基因克隆表达系统成熟完善
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
缺陷
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统
内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白
细胞周质内含有种类繁多的内***
（2）枯草芽孢杆菌
分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包涵体；不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解
（3）链霉菌
重要的工业微生物。不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有一定的糖基化能力
2、真核细胞
（1）酵母
特点：
真核生物细胞，表达产物能糖基化；
基因组小，仅为大肠杆菌的4倍；
世代时间短，繁殖迅速；
基因操作与原核生物相似；
建立了有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。
（2）丝状真菌
特点：
有很强的蛋白分泌能力；
能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等;
其糖基化方式与高等真核生物相似；
丝状真菌（如曲霉等）等被确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺。
真核生物和原核生物基因表达过程示意图
克隆载体: 克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆的DN***段数量大大增加
表达载体: 将外源基因或DN***段在宿主细胞中表达蛋白质
插入型载体: 将外源基因或DNA插入其中
置换型载体: 切除载体部分DNA，代之以外源基因或DNA。
载体（vector）
质粒（plasmid）
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主细胞染色体外而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。绝大多数质粒是DNA型的，天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。基因克隆的载体质粒DNA分子