基因工程课件章.ppt

基因工程课件章
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一．DNA的限制酶反应
1. 酶单位定义: 使1μg某种DNA在最适反应条件下和1小时内完全酶切所需的限制酶活性。
2. 酶切反应类型
1) 完全酶切 在两个不足之处：①酶1的选择不能靠近DNA中央；②需先分离DN***段，该法可克服上述缺点。
现假设有一片段长10 Kb，其中RE1有三个切点，RE2有一个切点，其图谱可能是:
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4. Bal31顺序酶解作图法
DN***段 Bal31处理不同时间取样终止反应 限制酶切
凝胶电泳 染色观察结果
5. 切口移位作图法(可检测出100bp片段)
双链DNA 切口移位 限制酶切 电泳 放射自显影
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6. 大尺度限制酶作图
1) 条件
i.    电泳方法---脉冲场凝胶电泳
ii.   样品制备---原位DNA制备和酶解
iii.  人工染色体构建---pYAC载体构建
iv.  脊椎动物基因组中的CpG和植物基因组中的CpXpG序列存在
2) 一般作图程序
原位DNA样品制备 原位DNA限制酶切 脉冲场凝胶电泳 染色 观察
3) 大尺度作图用酶
i.  稀有识别序列内切酶----I型内含子内切酶 (真菌细胞核和线粒体基因组,T4噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体)；酵母HO内切酶；大肠杆菌recA
虽然这些内切酶识别的序列都很长：10-19 bp，但高等动植物基因组中含有这类位点却极少，因而很少使用
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ii. II型限制酶
人基因组有45,000个CpG岛, kb富含GC的DN***段,其中只有25%的CpG岛未被***化,这些CpG岛常位于基因的5’-端,未被***化的CpG岛平均长约270 kb

可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别8或6 bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列
i)  AscI-GGCGCGCC和NotI-GCGGCCGC
ii)   FseI-GGCCGGCC和SrFI-GCCCGGGC
iii)   SfiI-GGCCNNNNNGGCC
iv)   CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCG
v)   BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和SacII-CCGCGG
vi)  NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,SmaI-CCCGGG
vii)  MluI-ACGCGT, NruI-TCGCGA, PvuI-CGATCG,
SplI-CGTACG
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
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三.  限制酶图谱的用途
1. 基因工程中的应用
1)  克隆载体图谱,便于DNA重组;
2)  克隆片段图谱可用于次克隆,体外突变,基因定位,核酸定序.
2. 突变体检测
遗传学图谱必须依赖各种突变体存在,因此必然发生了基因型和表型的变化.
限制酶图谱不必依赖表型变化,酶谱的变化一定是基因型发生了变化,但不一定发生了表型变化,即表型的变化不一定会导致酶谱变化.
1)  缺失突变体的检测:某DN***段消失,代之以一较小DN***段.
2)  插入突变体的检测:某DN***段消失,代之以一较大DN***段.
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缺失和插入突变体的检测（I）
I II
点突变的检测（II）
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3）点突变的检测: 某DN***段消失,代之以两较小的DN***(位点增加)；某两DN***段消失,代之以一较大DN***段，前者的长度之和等于后者长度(位点消失).
3.  重组频率的测定
同一染色体座位上的等位基因可能具有不同的表型,