primer5和Oligo的引物设计、使用方法.doc

primer5 和 Oligo 的引物设计、使用方法来自丁香园一、引物设计 step by step 1、在 NCBI 上搜索到目的基因,找到该基因的 mRNA ,在 CDS 选项中,找到编码区所在位置,在下面的 origin 中, Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用 Primer Premier5 搜索引物①打开 Primer Premier5 ,点击 File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口, Copy 目的序列在输入框内(选择 As ),此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。点击 Primer ,进入引物窗口。②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项,点击 Search 按钮,进入引物搜索框,选择“ PCR primers ”,“ Pairs ”,设定搜索区域和引物长度和产物长度。在 Search Parameter s 里面,可以设定相应参数。一般若无特殊需要,参数选择默认即可,但产物长度可以适当变化,因为 100 ~ 200bp 的产物电泳跑得较散,所以可以选择 300 ~ 500bp. ③点击 OK ,软件即开始自动搜索引物,搜索完成后,会自动跳出结果窗口,搜索结果默认按照评分( Rating )排序,点击其中任一个搜索结果,可以在“引物窗口”中,显示出该引物的综合情况,包括上游引物和下游引物的序列和位置,引物的各种信息等。④对于引物的序列,可以简单查看一下,避免出现下列情况: 3’不要出现连续的 3个碱基相连的情况,比如 GGG C ,否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括:T m应该在 55 ~ 70 度之间, GC %应该在 45 %~ 55 %间,上游引物和下游引物的 T m值最好不要相差太多,大概在 2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息,包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色,表示存在该二级结构,点击该红色按钮,即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物,应该都不存在这些二级结构,即这几个按钮都显示为“ None ”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物,所以要求可以适当放宽,比如引物存在错配的话,可以就具体情况考察该错配的效率如何,是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于 Oligo 来完成, Oligo 自身虽然带有引物搜索功能, 但其搜索出的引物质量感觉不如 Primer5. ⑤在 Primer5 窗口中,若觉得某一对引物合适,可以在搜索结果窗口中,点击该引物,然后在菜单栏,选择 File-Print-Current pair ,使用 PDF 虚拟打印机,即可转换为 Pdf 文档,里面有该引物的详细信息。 3、用 Oligo 验证评估引物①在 Oligo 软件界面, File 菜单下,选择 Open ,定位到目的 cDNA 序列(在 primer 中,该序列已经被保存为 Seq 文件),会跳出来两个窗口,分别为 Internal Stability ( Delta G)窗口和 Tm 窗口。在 Tm 窗口中,点击最左下角的按钮,会出来引物定位对话框,输入候选的上游引物序列位置( Primer 5 已经给出)即可,而引物长度可以通过点击 Change - Current oligo lengt