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分光光度计基本原理与结构
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许多化学物质具有颜色，有些无颜色的化合物也可以与显色剂作用，生成有色物质。实践证明，有色溶液的浓度越大，颜色越深；浓度越小，颜色越浅。因此，可以通过比较溶液颜色深浅的方法来色计和分光光度计的比色分析方法就是根据这一定律来进行的。但是，朗伯-比尔定律只适用于单色光和低浓度的有色溶液。
三、朗伯-比尔定律的应用
1．等吸光度法
从朗伯-比耳定律可知，当用同一光源照射同一物质的不同浓度溶液时，若吸光度相等，则两溶液各自的浓度和透光液层厚度的乘积也相等。利用此关系在可见光区用眼作检测器（目视比色法），即可求出待测溶液的浓度。
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2．计算法
根据被测溶液浓度的大致范围，先配制一已知浓度的标准溶液。用同样的方法处理标准溶液与被测溶液，使其成色后，在同样的实验条件下用同一台仪器分别测定它们的吸光度。
在标准溶液中：As=KsCsLs
在待测溶液中：Ax=KxCxLx
如果测定时选用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波长的单色光，保持温度相同，则K也相等。将两式相除可得
As/ Ax=Cs/Cx
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由此可见，在满足上述条件下，吸光度与溶液成正比。如果设计一种仪器，可以测量吸光度A值，则待测溶液的浓度即可求出
Cx=Ax/ As· Cs
由于仪器的性能和实验环境在不断的变化，所以在采用计算法时，必须每次都要对标准液和被测液进行测量，然后利用上式进行计算，否则会带来较大的测量误差。
由于一般光电比色计在结构上有不少偏离朗伯一比耳定律的地方，故欲得到较准确的结果，常采用标准曲线法。
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3．标准曲线法
这种方法分以下几步：
（1）先配制五种以上标准浓度的溶液。
（2）测出每种溶液的吸光度A。
（3）做A～C标准曲线图，如图4－3所示。
有了标准工作曲线便可对溶液进行测量。在同样的条件下，用仪器测出A后，查标准曲线即可得被测溶液的浓度值Cx。
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由于光电比色计工作在可见光区，只适合在有限个波长下测量，且波长的半宽度大。因此，它不能满足不同分析工作的需要。其次，光电比色计的灵敏度也低。为了克服以上不足，便发展了性能更好的分析方法：紫外--分光光度法。它利用单色器分光，其单色光纯度高，波长范围宽，并可连续变化，解决了光电比色计存在的问题。
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一、分光光度计基本原理和结构
分子，包括双原子分子的光谱，要比原子光谱复杂得多。这是由于在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转动。这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定的能级。分子的总能量可以认为是这三种能量的总和，即
E=E。＋E振＋E转
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当用频率为υ的电磁波照射分子，而该分子的较高能级与较低能级之差⊿E恰好等于该电磁波的能量 hυ时，即有
⊿E=hυ
这里，h为普朗克常数。此时，在微观上出现分子由较低的能级跃迁到较高的能级，在宏观上则表现为透射光的强度变小。若用一连续辐射的电磁波照射分子，将照射前后光强度的变化转变为电信号，并记录下来，就可以得到一张光强度变化对波长的关系曲线图——分子吸收光谱图。
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紫外--可见区的分子吸收光谱一般是谱带较宽的带状光谱，它是由于电子能级跃迁而产生的光谱，因此又叫做电子光谱。
分子吸收光谱与物质本身的结构有关，吸光度的大小与物质的含量有关，我们利用吸收光谱的形状和吸收程度的大小即可对物质进行定性和定量的分析。这种分析方法叫做分光光度法。
二、分光光度计的基本结构
与光电比色计相比，在结构上分光光度计用单色器代替了滤光片，其它部分两者比较相似。
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（－）单色器：单色器是指一个光学系统，它比滤光片能更有效地提供带宽窄的单色光。单色器的主要组件是玻璃棱镜、复合滤光片或光栅。来自光源的光线，可直接通过单色器的狭缝，照到分光部件上。单色器的效率比普通滤光片高。在紫外和可见光范围内，半宽度不超过1nm。
1．棱镜单色器
从几何光学我们知道，当一束光从一种介质射到另一种介质时，在界面会发生折射和反射，如图4-3所示。设入射角为i，折射角为θ，则其折射率n为:
n = Sini/sinθ
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不同的光学材料具有不同的折射率，这是众所周知的。