分子诊断技术的临床应用.ppt

分子诊断技术的临床应用
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狭义的分子诊断是基于核酸的诊断技术，是通过对DNA或RNA的检测来实现对疾病的检测和诊断。但是，随着第一张人类基因组测序图的完成，以及由此而带来的基因组学、蛋白组学、代谢物组学等新，本讲稿共32页
荧光定量PCR检测TB-DNA的意义
1. 能稳定检测10copy的TB-DNA ，灵敏度高 ，特异性强
2. 早期、快速、准确地诊断结核病。
痰液、肺及支气管灌洗液——肺结核
血液——播散性结核和各脏器的结核病
　 脑脊液——中枢神经系统结核病
宫颈拭子、尿道拭子——泌尿生殖道结核病
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3. 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。

4. TB-DNA浓度可用于判断疗效：
痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 ，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据
荧光定量PCR检测TB-DNA的意义
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二 肿瘤相关基因表达的检测：
1、包括癌基因、抗癌基因
2、肿瘤转移基因
3、转移抑制基因
三、荧光定量PCR技术的临床应用
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三 遗传病
1、等位基因检测
2、多基因遗传病的突变检测
3、基因表达异常所致遗传病检测
三、荧光定量PCR技术的临床应用
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四 其它应用
1. 法医学鉴定
2. 抗病毒药物疗效的观察、指导
3. 缩短诊断的窗口期
三、荧光定量PCR技术的临床应用
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窗口期：
所谓“窗口期”,是指从感染病原体开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原体存在为止的这一段时间。
美国90％以上输血传播HIV和HBV以及75％以上输血HCV的危险性均来自“窗口期”感染献血。
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提供直接证据缩短“窗口期”
PCR检测的临床意义
项目
ELISA窗口期
项目
NAT窗口期
HBsAg
50
HBV
20-25
抗-HCV
70
HCV
10-14
抗-HIV
15
HIV
10
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RNA+ Ab-
P24+ Ab -
血清阳转后的方法
RNA
p24
Ab
血清阳转
抗体检测临界值
特异性抗体比例
时间
反应指标
感染
血清阳转前的方法
怎样检测HIV早期感染?
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婴幼儿感染HIV诊断：12月内核酸检测，13-17月先抗体，阳性者检测核酸，18个月以上抗体检测
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四、PCR检测的标本采集要求
项目
标本采集
所需容器
CT
男性：
尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，旋转数圈取出分泌物（应略带粘膜），前列腺液、精液。
女性：
***分泌物：用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上
一次性无菌带盖的试管。
NG
UU
TP
HPV
HSV
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项目
标本采集
HBV
无菌注射器抽取2毫升静脉血或其它体液注入无菌试管或抗凝管。
HCV
EB
。
,但一般不推荐。
CMV
：中段晨尿20ml于加盖试管。
其他体液标本或咽拭子。
也可取抗凝血标本,但一般不推荐。
TB
：患者深部咳痰1～3ml于无菌加盖试管。
：留于无菌试管。
,但需分离单个核细胞检测，阳性率才会高。（于发热时抽取）
MP
咽拭子
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五、NAT（核酸检测）技术类型：
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实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）是将核酸恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型核酸检测技术。
国内公司（上海仁度生物科技有限公司）自主研发，拥有一整套自主知识产权和核心技术。
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（SAT）技术原理：
同一温度下（42℃），以RNA为起始模板，通过M-MLV反转录酶产生一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测