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PCR在HIV感染研究中的应用
前言
    简介HIV与PCR 技术
主体内容
    一、HIV的基因结构
    二、PCR在鉴定HIV感染中的意义
    三、HIV感染的定量PCR研究
    四、PCR的相关问题
    五、实例
结语
· 前言
    八十年代以来由人类免疫缺陷病毒HIV(Human Immunodeficiency Virus)感染而引起的艾滋病(AIDS)因其严重的危害性而受到人们高度重视。
图一: HIV 图二: HIV
力争早期诊断和寻求有效治疗是防止其广泛传播的关键所在。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)
    1985年,Mallis等根据核酸自然扩增理论,建立了一种人工体外DNA扩增技术,即聚合酶链式反应,并于1987年完成了自动化操作,极大地推动了分子生物学的发展,也为包括病毒感染在内的临床疾病诊断提供了一种崭新的手段。
1、PCR的基本原理
    靶DNA分子变性后解链,两条单链DNA分别经复性与两条引物互补结合,在4种dNTP存在和合适的条件下,由DNA 聚合酶催化引物由
5’->3’扩增延长,每经过变性、复性、延伸一个循环,模板DNA增加1倍,新合成的DNA链又可作为下一个循环的模板,经过30~50个循环,可使原DNA量增加106~109倍。
2、主要步骤
    PCR的每一循环包括变性、复性、延伸3个步骤, 此外整个试验应包括DNA模板提取,如果模板为RNA,还需增加从RNA到DNA的逆转录过程。除模板提取外,这些操作均可在同一系统中完成,仅仅改变反应温度即可完成。
3、引物的设计
4、常用的PCR技术(定量PCR等)
5、PCR产物的分析(凝胶电泳等方法)
    PCR具有敏感、特异和快速的特点,是检测艾滋病病毒、评价病情进展和探讨发病机理的有效工具。
    本文将就目前HIV与PCR研究的现状,谈谈PCR技术在HIV研究中的应用。
一、HIV的基因结构
    HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同,为RNA双分子,其单链RNA分子由9749个核苷酸组成,有3组共9个基因。
HIV 的模式图
    第一组为逆转录病毒共同的基因:gag、 pol、 env基因,及侧翼的长末端重复顺序(LTR)等。第二组为调节基因表达的基因:tat、 rev、 nef。第三组为特有基因:vif 、vpu、 vpr
HIV 基因组的蛋白产物
    HIV有十分高的遗传变异率,是一个多态性病毒。高度变异区在env基因内,相当于gp120的五个区段,gag和pol基因较少变异。目前已知HIV有两个型:HIV-1和 HIV-2。
    因此,只有选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因加以扩增,才能有效地检测所有HIV的变异性。
二、 PCR在鉴定HIV感染中的意义
    HIV常可引起潜伏感染,但仍具有传染性,整合的病毒基因组在每个细胞中仅以很低的DNA拷贝数存在,因此,需要建立一个敏感而又特异的HIV检测方法。
传统的HIV检测方法
· 病毒体外培养法
· 逆转录酶法
· 外周血液中核衣壳抗原直接检测法
· 原位杂交法
· Southern印迹法等等
缺点:比较费时费力