苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3aa在虫生真菌孢白僵菌中的表达.pdf

摘要球孢白僵菌作为最为常见的虫生真菌,寄主范围广,且易于大量生产,在自然环境中有时能在寄主种群中形成流行病,有利于抑制虫口的大发生。但由于其对害虫的致死时间较长、对环境条件要求又高,所以球孢白僵菌杀虫剂应用的广泛性受到限制。利用基因工程技术提高菌株毒力是当今世界上关注的研究热点。本文以球孢白僵菌 Bb13 和 Bb1944 作为出发菌株,分别引入苏云金杆菌的营养期杀虫蛋白基因 Vip3Aa , 构建了两个转基因工程菌株。根据苏云金杆菌营养期杀虫蛋白基因 Vip3Aa 序列设计全基因扩增引物,并在引物两端添加合适的酶切位点 EcoRI 和 XhoI ,对目的基因进行 PCR 扩增,将纯化的 PCR 产物和含有筛选标记 bar 基因的载体 pbarGPE1 质粒分别进行 XhoI 和 EcoRI 双酶切,再次纯化,然后,将两者的纯化物进行连接,构建成真菌表达载体 pbarGPE1-vip3Aa 。将构建好的质粒经 ScaI 酶切线性化后,利用芽生孢子转化法转入虫生真菌球孢白僵菌 Bb13 和 Bb1944 菌株内,得到白僵菌工程菌株 Bb13V 和 Bb1944V 。RT-PCR 结果证明 Vip3Aa 在两个工程菌株中均能得到成功转录。在室内恒温 25 ℃条件下,用喂食、喷雾以及两者相结合的方法,分别测定 1×10 5 、 1×10 6 、 1×10 7 、 1×10 8 和 2×10 8 孢子/ml 五个不同孢子浓度下 Bb13 和 Bb1944 的原始菌株和工程菌株对二龄马尾松毛虫和玉米螟的毒力,将测定结果用 DPS 进行数据分析。对松毛虫测定的结果表明,在 2×10 8 孢子/ml 孢子浓度下,工程菌株和非工程菌株间致死率差异不大。在 1×10 5 、 1×10 6 、1×10 7 和 1×10 8 孢子/ml 四个不同孢子浓度下处理条件下,采取 3 种不同的处理方式,工程菌株均原始菌株致死率提高 30% 以上; 喷雾处理的毒力提高 ~ 倍;喂食处理组的致死率均高于喷雾处理。在所有处理中,喂食和喷雾相结合的处理组致死率最高。在 1×10 8 孢子/ml 浓度下,喂食处理的致死率显著高于喷雾处理,致死中时缩短 。对玉米螟测定的结果表明,工程菌株各处理组均比原始菌株的死亡率高;喷雾处理的毒力提高了 ~ 倍;在 2×10 8 孢子/ml 浓度下,喷雾组的致死中时( ) 比原始菌株( )缩短了 。两个菌株的毒力测定都说明 Vip3Aa 基因在转入白僵菌后得到了表达,使得工程菌对松毛虫和玉米螟的毒力明显增强。关键词:球孢白僵菌, Vip3Aa 基因,载体构建,毒力测定 I Abstract Beauveria bassiana is one of the mon entomogenous fungi, with wide host range and great convenience for massproduction, and in its natural medium , sometimes it possibly causes epidemic in between the host population which is beneficial to represses pests breed ing rapidly or abundantly. However, like other entomogenous fungi, it always kills insects more slowly than ch emical insecticides and this disadvantage discourages the use of it in insect pest c ontrol. Therefore, impr oving its virulence using ic engineering technology to increase my coinsecticide products in market is of significant application value . In this study, foreign gene Vip3Aa from Bacillus thuringiensis was transformed into two initial strains Bb13 and Bb1944, resulting in construction of two monocopic chitinase-overexpressive transg