小鼠和人胚胎干细胞向神经细胞分化.pdf

上海交通大学博士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名:)虱霉徊日期:∥8年F月yEl黝{宝嘲上海交通大学博士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密囱,在上年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。(请在以上方框内打“4”)学位论文储签名:僻缃指导教师签名:日期:妒譬年与月FE1日期:圳年扩月6日上海交通大学博士学位论文小鼠和人胚胎千细胞向神经细胞的分化摘要随着老龄化时代的来临,神经系统退行性疾病越来越引起了社会的广泛关注。研究胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES细胞)的体外神经分化,得到大量的神经前体细胞和特定类型的神经元,有望为早期神经发育的研究、神经药理和毒理研究以及神经系统退行性疾病的细胞替代治疗提供研究模型和细胞来源。本研究针对小鼠和人ES细胞向神经细胞的分化进行了研究,主要包括了以下两方面的工作:(一)小鼠ES细胞的神经分化:我们研究的重点和创新体现在密度对小鼠ES细胞神经分化的效率和细胞类型的研究上。本研究发现,小鼠ES细胞在无血清的培养环境里,ES细胞悬浮培养时的接种密度对类胚体(embryonicbody,EB)质量有很大的影响并影响随后的神经分化效率:当小鼠ES细胞以较低密度(1×i05EScells/m1)悬浮培养时,得到的EB形态较为均一,呈规则的圆形,耶的形态较紧密,边界亮而光滑,这样的EB贴壁培养后,神经分化的效率较高,Nestin阳性细胞约占92%;小鼠ES细胞以较高密度(1×106EScells/m1)悬浮培养时,EB的大小不均一,形态不规则,边界不光滑,这样的EB贴壁培养后,神经分化的效率较低,Nestin阳性细胞约占50%。本研究还发现,EB贴壁培养时的上海交通大学博士学位论文接种密度也影响分化得到的神经细胞类型:EB低密度贴壁培养后长出的细胞更倾向于表达后脑和脊髓特异性的定位基因Hoxb4、Hoxb9。(二)人ES细胞的神经分化:首先我们采用EB法进行了人ES细胞的神经诱导分化,并且我们对该EB进行了改进,从而提高了诱导效率。我们的诱导方案的创新性主要体现在两个方面:一是在EB形成阶段,用化学成分明确的促进神经细胞增殖的培养基替代了以往报道中选用的含血清的培养基从而提高了诱导效率;二是在髓贴壁后长出的玫瑰花结样结构,我们用机械法挑取代替了以往报道中所采用的差别酶消化法从而提高了目的细胞的纯度。我们的实验结果显示,这些改进可以明显提高人ES细胞的神经诱导效率。尽管通过以上实验方法的改进,我们用EB法诱导人ES细胞的神经分化得到了较好的实验结果,但在实验过程中发现类胚体法有很多不足之处。单层贴壁诱导法是一种新的神经诱导方法,细胞的分化较同步;而且细胞的形态改变易于观察,细胞的分化进展易于通过免疫组织化学染色等实验手段实时监测。本研究在BMP4的抑制剂Noggin的作用下,应有单层贴壁诱导法高效地把人ES细胞诱导成了神经细胞,且神经发生的时间早于EB法。我们的研究还初步证实,单层贴壁诱导法的早期即添加FGF8和SHH可以大大促进多巴胺能神经元的分化,为我们下一步的实验奠定了良好的基础。关键词:小鼠胚胎干细胞,人胚胎干细胞,定向诱导,(ES)