研究生实验二.ppt

实验二、ELISPOT —单细胞分析技术基础医学院免疫学教研室徐琦副教授1ELISPOT简介 ELISPOT是在ELISA 技术的基础上建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体和细胞因子的细胞,并具有较高的特异性和敏感性,目前正被国内外广泛应用。2ELISPOT技术的发展?ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky 等人率先在1983年,运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。?早期ELISPOT的分析条件不是非常理想,成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决。?直到1996年PVDF薄膜的应用(Forsthuber et al., Science, 1996),才解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比,PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体,使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏,让呈色斑点集中、清晰、对比色高,大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。31996年以来随着抗体制备、PVDF膜等技术改良,ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待,它已是当世公认最灵敏抗原特异性T细胞的体外检测技术。4ELISPOT与ELISA的比较它们最大的不同在于:?1. ELISA通过显色反应,在酶标仪上测定吸光度,与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。?2. ELISPOT也是通过显色反应,在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点,可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数,1个斑点代表1个细胞,从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率;?3. 由于是单细胞水平检测,ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏,能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。?4. 刺激剂激活细胞时,不会影响活化细胞分泌细胞因子。5106抗原呈递细胞(APC)中混入特定数量的IFN-γ+的T淋巴细胞,经下列方法检测:?ELISPOT?细胞内细胞因子染色(FACS)?ELISAX坐标:106 APC中实际IFN-γ+T细胞数量Y坐标:各检测方法的检测结果 ELISPOT/FACS/ELISA 检测精确度比较6BD ELISPOT 技术优势?单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子?观察活细胞应答(动态)结果能计数效应细胞,分析效应分子产生频率?#of Spots: cell numbers/ frequency?size of Spots: relative amount produced?高灵敏度,高产量,大容量T 细胞分析成为可行。?只需要少量样本即可进行检测分析。?淋巴细胞在ELISPOT 分析后依然存活。这使得分析之后可以用于进行增殖,用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能。7BD ELISPOT 应用?移植研究?疫苗开发-亦可评估疫苗效力,或是疫苗注射路径影响?Th0/Th1/Th2细胞转换分析?自体免疫研究–免疫调节及免疫治疗研究?癌症研究-肿瘤反应T细胞作用?过敏机制探讨– IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换,其它参与过敏机制之细胞因子研究?传染疾病研究?体液免疫研究– B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究8BD ,用来吸附特殊挑选、且无毒性(不含sodium azide、内***endotoxin)的单株抗体。,再接受适当的抗原刺激,并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言,记忆性T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子,此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。,被捕获的细胞因子可进一步使用生物素(Biotin)标记的一抗来标识,其后再与辣根过氧化物酶标记的亲合素作用,并加入底物使其呈色,有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。9BD ELISPOT