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....亚细胞核的分离和鉴定关键词:细胞试剂试剂盒甲苯***蓝试剂标准物质北京标准物质网1、细胞核的分离细胞核作为一个功能单位,完整地保存遗传物质,并指导RNA合成,进而表达出相应的蛋白,在一定程度上细胞核控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖活动。因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后,可用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化。细胞核的分离目前较常采用以蔗糖为介质的差速离心法,可分为细胞核分离和纯化两大步骤。细胞匀浆后,。的蔗糖1000g离心洗涤,/L的蔗糖梯度中1500g离心15~20分钟,沉淀即为纯化的细胞核。现在细胞核的提取试剂已商业化生产,公司试剂盒中会提供详细的操作步骤。细胞核被分离后,可经甲苯***蓝染色在光学显微镜下观察,或直接在电子显微镜下观察核内染色质的分布情况。2、细胞核的鉴定(1)光镜直接观察:普通光学显微镜下,贴壁细胞的细胞核为位于细胞中央的一团较深物质,悬浮细胞会显得更模糊,且都无法清晰分辨细胞核与细胞质。常用于细胞核的化学染料包括甲紫、苏木精、醋酸洋红、***绿等。,是组织学、胚胎学和病理学最常用最基本的细胞核细胞质染色方法,细胞核嗜碱被苏木精染成蓝色(图5-3-1)。....(2)电镜观察:电镜能清晰地观察到细胞核基质的基本形态,以及核膜、核仁、核染色质等,所以可以被应用到细胞核的可视化研究中。比如细胞凋亡,电镜下清晰可见,核基质由结构完整到出现紊乱,到凋亡小体的形成并由核内排出。因此,电镜扫描可以清晰展示出细胞核的各个阶段的状态,能更形象化地应用于细胞核功能学、发育学以及细胞凋亡等研究中(图5-3-2)。(3)细胞学鉴定:核酸荧光染色后,可采用荧光显微镜、共聚焦激光扫描荧光显微镜以及流式细胞仪检测。常用的三大经典核酸染料包括:插入性染料,如:ethidiumbromide(EB)和propidiumiodide(PI);DNA小沟结台染料,如:DAPI和Hoechst:以及其他类核酸染料,如:吖啶橙、7-AAD、LDS751等。DAPI是一种具有膜通透性的强力DNA荧光染料,可用于活细胞以及死细胞的细胞核染色。荧光显微镜下,DAPI可被紫外光激发出蓝色荧光,其荧光激发光358nm以及发射光461nm。因为彼此的发射光很少重叠,DAPI通常与绿色荧光(如GFP)和红色荧光(如RFP)结合,三者被用于细胞的多重荧光染色(图5-3-3)。Hoechst染料常用的有Hoechst33258和Hoechst33342,其激发光和发射光与DAPI非常相似,都可用于活细胞和固定细胞的标记。DAPI和Hoechst染料是科研人员最常使用的用于细胞核标记的荧光染料。....此外,在细胞增殖的研究中,人们常常将Brdu/Edu等底物掺入到增殖的细胞核DNA链中,再通过荧光素标记Brdu/Edu,继而显色增殖细胞的细胞核。在细胞凋亡研究中,人们常采用TUNEL染色标记凋亡细胞的细胞核。由于三维重建等优点,共聚焦显