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家蚕亲环蛋白A表达和亚细胞定位的研究.pdf


文档分类:医学/心理学 | 页数:约64页 举报非法文档有奖
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浙江理工大学硕士学位论文摘要亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)是发现于1984年的一族胞浆蛋白,因其能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而得名。CsA作为一种免疫抑制剂,在人类器官移植中,是预防移植排斥反应的重要药物。CsA可通过干扰T细胞的信号传导途径以阻断钙调磷酸酶的活性。而CsA只有在与其目的蛋白Cylophilin形成CsA---Cyclophilin复合体后才使T细胞膜蛋白错误折叠从而发挥免疫抑制作用。我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,序列比对后推测可能是家蚕亲环蛋白A基因,我们将其命名为BmCyPA,GenBank登录号为AB206402。该基因序列ORF长为498bp,编码166个氨基酸,。我们将扩增到的BmCyPA基因克隆到融合表达载体pET-28a相应的酶切位点上,得到融合蛋白表达质粒pET-28a(+)-BmCyPA,经PCR、酶切鉴定以及测序证明重组子是正确的。将该重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),,裂解细菌做SDS—PAGE检测分析,与阴性对照相比在22kDa处有一特异性蛋白条带,与预期值(,)相符。融合蛋白以可溶性形式表达,故用超声裂解菌体后12000rpm离心所得上清以亲和层析的方法纯化目的蛋白His-tagBmCyPA。经FPLC反相柱层析进一步纯化后,再进行质谱分析,,证实了该蛋白表达的J下确性。以纯化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价可达到1:12800以上。提取家蚕五龄幼虫的各组织蛋白,用于Westernblotting实验。实验结果表明,BmCyPA蛋白在家蚕的马氏管、气门、表皮、脂肪体、中肠、丝腺、头部、卵巢中均有表达。亚细胞定位结果表明,该蛋白主要存在于细胞质中。我们还利用荧光定量PCR的方法,对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾等发育时期,以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的量进行比较。关键词家蚕;亲环蛋白A;原核表达;组织定位;亚细胞定位;荧光定量PCR浙江理工大学硕士学位论文AbstractCyclophilin,(CsA).'——scaleeDNAsequencingofsilkwormpupae,aBombyxmoriCyclophilinAeDNAwasidentifiedafterBlastbasedonNCBIdatabase,,(DE3),theBmCyPAWasfusedwithHis-(,),characterizedbymass·-,antiserumWasharvested,

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