western blot经验总结,整理版.docx

样品制备: 变性条件—— SDS LB 直接裂解: 用常温或者高温预热过( 预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化, 但容易遗忘, LB 久煮某些性质会改变)的 1*SDS LB( 或者略高 * ) 直接加到细胞或者组织上并煮样。通常 6 孔板细胞 80% 以上密度,需 200ul , 其他按平板面积比类推。通常条件下, SDS LB 都是过量的(因此不一定要严格参考 SDS LB 稀释比);如果 SDS LB 不够,样品核酸、蛋白浓度过高时,煮样后会发现 tip 吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住 tip 。这时候常规做法有两种, 1. 再煮 5min 。常规煮样时间 3-5min , 样品过浓时就煮 10min ; 2. 如果 10min 煮样后, 仍然吸不起来, 才适当增加 SDS LB, 继续煮; 也可以对样品进行超声。煮样时间若过长, 蛋白会凝固, 此时以失去继续 WB 的意义, 请丢弃( 判断标准: 出现明显的蛋白沉淀和水分层) 此方法的缺点, SDS LB 煮过的样品如果用来做 IP, 需要特殊方法, 因此, 这种制备方法制备的样品有使用局限。非变性裂解法(不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了,其实类似) 裂解细胞请尽量冰上操作,减缓酶解作用。俺前 boss nature 文章上的裂解液配方是: 20mM Tris/HCl, , 100mM NaCl, 20mM KCl, MgCl2, % NP-40 and protease inhibitors (20 μ g/ml leupeptin, 10μ g/ml pepstatin A and 10μ g/ml aprotinin) ( 此裂解液可用于抽提核蛋白), 其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵, 其实用 PMSF 替代这三种就好了; 如果还要做磷酸化蛋白,加 1mM Na3VO4 (现加现用), 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP 。此方法的优点: NaCl 浓度略低于生理状态, 保证裂解细胞的方式较为温和, 便于随后的 IP 等试验。其他 Na 盐浓度的细胞裂解液也很常见, 诸如 ( 生理盐浓度)、 、 (高盐系列,裂解细胞时染色体会析出,细胞碎片和沉淀非常粘稠)及 - ; 及以下适合 IP 试验, 及以上适合纯化蛋白,尤其相互作用较强的复合体,要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。用于核蛋白的裂解的原因是 % NP-40 ,用于破坏核膜结构;可用到 1% ,但此时染色体会析出,沉淀粘稠。组织块裂解: 组织块较大用匀浆的方法最合适,现在有不少转头很小的匀浆器。当组织超微量的时候,比如 50mg 新鲜癌组织,我采用的方法是 1. 低温(剪)搅碎,成肉糜状。 2. 锡箔纸包裹好,放入少量液氮,快速敲击(控制力量,尽量避免弄破锡箔纸),进一步破碎;反复多次。 3. 用上述细胞裂解液回收。分泌型蛋白富集: 用无血清培养基培养细胞, 收集上清液用于 WB 检测; 如果含量过低, 需要用 TCA 沉淀富集。理论上, 从普通培养基中收集分泌蛋白, 此时对细胞生长条件的影响最小, 是最佳的实验条件; 但是这存在隐忧。因为含血清的培养基中含有非常丰富的 BSA ( 牛血清白蛋白) 之类的蛋白质, 除非你进一步分离纯化, 否则直接用这种样品去 WB 会有非常大的麻烦, 尤其当你的蛋白在 60-46 kDa 之间的时候;用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白,会有一片非常强的信号。因为此区间蛋白( 主要是 BSA ) 浓度过于富*** 非特异性粘附“任意”抗体,从而最终被识别。同理,采用 SDS LB 裂解细胞制备样品前,通常要用 PB S 洗涤,其目的之一是去除培养基中的 BSA 。采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外(可能激活未知信号途径, 诸如 AKT 等),还会出现的问题是: 1. 即使采用了无血清收集上清,仍然有大量杂蛋白,但相对好很多。 2. 选用了上清,由于蛋白浓度太稀,通常要采用 TCA 沉淀富集,再重新溶解。 a. TCA 沉淀对半定量操作要求非常高, 因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失, 尤其在离心过程,离心管的摆放非常讲究,要 180 度翻转离心两次。 b 。重新溶解时,由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解,你要摸索充分溶解的条件,相对麻烦。实际上, 如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能, 一般不建议检测上清, 尤其半定量的WB 实验检测不同样品间的差异。这里面有实验操作细节的麻烦——经验之谈, 我曾经参与的 cancer cell 文章所研究的蛋