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基因工程5
具有核糖体结合位点；
具有克隆基因的功能（强）启动子；
插入序列的正确取向。
真核基因在大肠杆菌中的表达
克隆基因表达活性的检测
；
；
、
14C标记得***霉素
乙酰辅酶A
薄层层析
放射自显影
CAT活性的检测：
***霉素乙酰转移酶
可以催化***霉素（2-或3-）
发生乙酰化作用。
使用tetr作报告基因分离功能启动子
1. 首先在大肠杆菌质粒pBR316（含有一个tet基因、Hind 位点）上的tet的启动子序列中插入一个EcoR1的酶切位点（ pBRH3B, pBRH1 ），使之失活。
2. 将纯化的细菌染色体DN***断，克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位点上；转化给对tet敏感的大肠杆菌寄主细胞。
使用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子
能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。
来源于pBR322
转译终止密码子
无启动子的galK
原理：
半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。
用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因（galK）表达的半乳糖激酶的产量。
分离功能的启动子：
将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒载体的MCS区的单克隆位点上；
将体外连接的DNA重组分子，转化给具GalE＋、 GalK －的大肠杆菌寄主细胞，避免内源半乳糖激酶的干扰；
将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化子（重组子产生红色的菌落）。
pOK1质粒载体分离功能启动子的因素
1. 选用的报告基因galK的编码产物半乳糖激酶，是一种易于快速定量检测的蛋白质（鉴定启动子表达活性的强弱）；
2. 应用麦氏培养基的显色反应特性，筛选能够利用半乳糖的转化子（分离功能启动子）。
（ GalE+ GalT+ GalK－）作转化受体；
常用的大肠杆菌表达载体
1. Lac启动子的表达载体
2. Trp启动子的表达载体
3. PL启动子的表达载体
理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。因此，每当有一个克隆的外源DN***断插入到这个启动子之后，人保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。
1. 经过Hae 切割的203bp的酶切片断上具有Lac操纵子的控制区，包括阻遏物作用区、CAP作用区以及RNA聚合酶作用区、 β-半乳糖苷酶的头8个密码子。 有一些对阻遏物作用不敏感的启动子，也被用来制备表达载体
2. 95bp的Alu片断：不完整的CAP结合序列
3. L8突变的203bp区段，在CAP结合序列里发生了G-A的转换
4. 在uv5突变，使lac启动子开始的转录显得更有效。（RNA聚合酶结合区T-A颠换,相邻碱基G-A的转换）
质粒的构建：
将含有lac启动子的Hae 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。
增加2个碱基对
Trp启动子的表达载体
这种表达载体的优点是，它所合成的蛋白质产量高于lac启动子表达载体系统，并且是诱导型的。
构建：
1. Hind 片断， 含有trp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、 trpE基因、 trpD基因的部分序列。
2. 将此片断，克隆到pBR322质粒的Hind 位点，构建成了ptrpED3表达载体（含有两个Hind 位点）。
3. Hind部分酶切消化，将靠近EcoR1位点的一个Hind 位点，经核酸外切酶 和S1核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体ptrpED5-1.
使用Hind 接头，将ptrpED5-1质粒的Hinf1片断克隆到了pBR322质粒的Hind 位点上，形成重组质粒pWT111
（含有trp调节序列和trpE基因的头7个密码子）。
Trp启动子表达载体已用来生产了α-干扰素和γ-干扰素
三启动子串联单元表达效率高于单启动子单元
PL启动子的表达载体
是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的