DNA分子的电镜制样和观察.doc

DNA 分子的电镜制样及观察任春梅洪亚辉董延瑜张学文赵燕(湖南农业大学生物技术系,长沙, 410128 ) [摘要]摸索了 DNA 分子的水展膜电镜制样方法与技术,在无旋转投影设备的条件下, 直接用透射电镜观察到了 DNA 分子的线型结构. [关键词]脱氧核糖核酸;电子显微镜;观察[分类号] Q-336 DNA 是生物的遗传基础,提取 DNA 是进行生物遗传转化的首要步骤。我校植物遗传工程研究室从 1987 年开始摸索各种作物 DN A 的提取纯化方法,对水稻、小麦、玉米、高梁、大豆等多种作物建立了完整的 DNA 提取、纯化和检测流程。为了使所提取的的 DNA 能更直观地展现在人们面前,我们于 1990 年 10月,根据当时的条件,反复进行了 DN A分子的电镜制样,在电镜下观察到了 DNA 分子的线型结构. 1 材料与方法 材料供试材料为提取、纯化的水稻、小麦、玉米、高梁、平菇、茶树等作物的 DN A 方法 玻片、镊子的清洁把玻片、镊子放在大烧杯中,加入适量的浓 H 2 SO 4 处理 20mi n ,倒出浓 H 2 SO 4· 用自来水冲洗数次, 再用蒸馏水洗 3—5次,最后保存在 95%乙醇中备用. 铜网的清洁把铜网放在小烧杯中,加入适量浓 H 2 SO 4处理 20m in后,倒出浓 H 2 SO 4,加蒸馏水漂洗 3—5次;加氨水中和残留的酸;蒸馏水洗数次;重蒸水洗 2次;保存在 95%乙醇中备用。如果是用过的铜网,应先放入***仿中浸泡 20min ,再按上述方法清洁. Formar 膜的制备( 1)配制 o. 5%聚乙烯醇缩甲醛***仿液(简称 Formar 膜液),室温下放置 。( 2)将膜液倒入干净烧杯中,另取一干净玻璃缸加满重蒸水。( 3)取一干净玻片垂直插入膜液中,数秒钟后取出。( 4)待氛仿挥发后,用锋利尖刀在玻片四周划痕。( 5)双手捏玻片垂直缓慢地插入重蒸水中,随着玻片的插入,膜脱落下来,浮在水面上。( 6)用干净镊子夹着铜网(铜网粗糙无光泽的一面朝下),轻轻地逐个摆在漂浮的膜上。( 7)。 水展膜法制样( 1) 配制上相液和下相液。上相液的配制:在无菌小离心管中加入 6 mol / L醋酸铵 10μ L, 50 mm ol/ L的 Tris — HCl 缓冲液(pH8 . 5)lO μ L。 2m g/ mL 5mm ol/ L EDTA(PH8 . 5)10 μ L, 2 mg / mL 细胞色素 C10 μ L 。加适量 DNA 和重蒸水使总体积为 60μ L。 DNA 的最终浓度为 — g/ mL 。下相液为蒸馏水。( 2)展膜。取直径为 8一 l0 cm 。将一干净玻片斜放在培养皿上。一端浸入下相液,另一端放在培养皿边缘上。在下相液表面撤少许滑石粉。用微量取液器取 20μ L上相液,在离下相液表面 1cm 处轻轻地滴到斜面玻片上。上相液顺着斜面缓缓流下, ,单分子膜可以从滑石粉在液面被推开时而观察到。( 3) 铜网捞取单分子膜。用镊子夹着铜网,使有膜的一面朝下。