第二章蛋白质的检测和分离.ppt

第二章蛋白质的检测和分离
二、为什么要分离提纯蛋白质?
4、蛋白质结构与功能研究及基因工程研究的需要
均一的蛋白制剂
工具酶
高纯度的标准蛋白
三、对蛋白质分离提纯的要求
1、纯度
决定于研究的目的和应用上的要求的方法：
(1)显微镜观察；
(2)用分度管检查
将破碎细胞的悬浮液装于分度管中，离心3分钟，未碎的完整细胞首先沉降，在它上面是细胞碎片，再上面是细胞质部分。每一层的相对含量即表示细胞破碎程度。
三、抽提
抽提就是将破碎细胞中的蛋白质溶解在适当的溶剂中。
根据所需蛋白质溶解性，采用适当的溶剂抽提。
水溶性的清蛋白(如：血清白蛋白、卵清蛋白等)可以用水抽提；
不溶于水的盐溶性球蛋白(如：血红蛋白、肌红蛋白等)可以用稀中性盐溶液()抽提；
三、抽提
不溶于水和盐溶液但可溶于稀碱溶液的米谷蛋白和麦谷蛋白，可以用稀碱溶液抽提；
不溶于水和中性盐溶液，但能溶于70～80％乙醇溶液中的醇溶蛋白(如醇溶谷蛋白)，可以用70～80％乙醇溶液抽提；
脂蛋白要用表面活性剂(即洗涤剂)才能抽提出来，
膜蛋白往往用非离子型表面活性剂的稀溶液抽提。
不溶性蛋白，如角蛋白、胶原、丝心蛋白，可以用适当的溶剂洗去可溶物。
三、抽提
使用类似于生理条件下的缓冲液
20～50mmol/L的磷酸缓冲液(～)
Tris-HCI()

必要时，可加入EDTA(1～5mmol/L)，巯基乙醇(3-20mmol/L)或蛋白质稳定剂等。
三、抽提
抽提的原则是：少量多次。
三、抽提
抽提过程中需要注意：
①低温(0℃-4℃)抽提；
②抽提蛋白水解酶时，须加入抑制剂；
如：以Ser为活性中心的酶，加二异丙基***磷酸(DFP)，以巯基为活性中心的酶，加对******苯甲酸(PCMB)。
③抽提含有活性巯基的蛋白质时，要保护巯基
不要带入金属离子，可加入金属螯合剂，如EDTA；
不要带进氧化剂，可加入还原剂，如抗坏血酸等；
三、抽提
抽提过程中需要注意：
④抽提带非共价键结合的配基的蛋白质时，要保护配基，不要使其丢失；
⑤选择抽提条件时应考虑，尽量减少非蛋白质杂质被同时抽提出来；
⑥如实验材料含有大量的脂肪，为了避免它干扰以后的分离提纯操作，须用有机溶剂(如：***、石油醚)萃取，以去除脂肪。
三、抽提
抽提过程中需要注意：
⑦防止植物组织中的多酚物质，氧化褐变，干扰蛋白质的分离提纯。
⑧对植物组织使用较高浓度的缓冲液作为抽提液，防止植物细胞的内含物改变抽提液的pH值。
⑨抽提外周膜蛋白时，必须用含有EDTA的适当缓冲液；抽提内嵌膜蛋白时，必须用去污剂作增溶剂。
⑩可用高速离心法和过滤法(添加适当的助滤剂)使粗提液澄清。粗提液中如有大量核酸，可用核酸酶或用鱼精蛋白去除。
第三节 蛋白质的粗分离
根据蛋白质的溶解度差异分离
根据蛋白质分子大小的差异分离
盐析法
原理：是将硫酸铵、硫酸钠或***化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素被去除沉淀。
优点：沉淀的蛋白质保持着它的天然构象，能再溶解。
一、根据蛋白质溶解性的差异分离
有机溶剂分级分离法
选择原则：与水完全混溶
不与蛋白质反应
有较好的沉淀效应
溶剂蒸气无毒、不易燃
原理：是将有机溶剂（***、乙醇)加入蛋白质溶液中，导致溶液介电常数降低，增加了相反电荷之间的吸引力，蛋白质分子表面可解离基的离子化强度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。
有机溶剂
优点：比盐析法分辨率高，提纯效果好，生产中应用多。
注意事项：使用***沉淀时，必须在0～4℃下进行。***用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被***沉淀后，应立即分离，防止变性。

水溶***高聚物
聚乙二醇（PEG）
聚丙烯酸——碱性蛋白质

极端条件
热、pH、有机溶剂
等电点沉淀
***仿——血红蛋白
免疫沉淀
抗原抗体特异结合形成不溶性复合物
透析
透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法 。只用于除盐类和小分子杂质
二、根据蛋白质分子大小的差异分离
：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质
加压
蛋白质溶液
半透膜
超滤液
支持膜的栅板