实时荧光定量PCR(RT PCR).doc

实时荧光定量PCR (RT-PCR)
关键词:实时荧光定量PCR RT-PCR原理荧光阈值 Ct值标准曲线的绘制荧光扩增曲线
一实时荧光定量PCR
在PCR反应中,无论是定性还是定量分析,分析的都是PCR的终产物。但是有时候想知道的却是未经PCR放大之前的起始模板量,RT-PCR应用而生。
-PCR原理

图1 原理图图2 Taqmen 探针
如图2 Taqmen 探针,5’端标记有报告基团R可发出荧光信号,3’端标记有荧光淬灭基团Q可吸收荧光信号。探针的本质就是一寡核苷酸链。
如图1 在PCR的反应过程中加入一寡核苷酸链(DNA/RNA),我们称之为探针。当探针完整时,报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收,从而不被检测出来。当PCR扩增至探针所在位置时,Taq DNA聚合酶具有的核酸外切酶活性会将探针5’端的报告基团切断,使其远离探针本身,这时产生的荧光信号就不能被淬灭基团吸收,而被仪器检测出来。每扩增一条DNA链就会有一个荧光分子产生,通过荧光信号的积累量实时监测整个PCR反应中每一个循环扩增产物量的变化,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
为了定量和比较的方便,在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和 CT 值。
(threshold)
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,一般荧光阈值的默认设置值是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

Ct(Cycle threshold):每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。不同浓度的起始模板到达荧光设定阈值的循环数不同,即Ct值不同。得到Ct值,即可通过标准曲线计算出起始模板量。
荧光阈值和Ct值得关系(如图1 Ct值的确定)。模板DNA量越多,荧光达到阈值所经历的循环数越少,Ct值越小(如图2)。如果用已知起始拷贝数标准品作标准曲线,横坐标是起始拷贝数的对数,纵坐标是Ct值。只要获得未知样品的Ct值,就可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图1 如图Ct值是荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数
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