实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

实验八：不连续聚丙烯酰***凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
一、 不连续聚丙烯酰***凝胶电泳
实验操作及注意事项 （P138）
实验分组（每人做一管，每组配一份胶）
 认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）
 
封管
的等电点（PI）。

2. 溶液pH与蛋白质等电点决定蛋白质电荷性质与数量
3. 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异
实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）
1. 纸电泳：是最早使用的一种电泳技术，滤纸为支持物
2. 醋酸纤维膜电泳：醋酸纤维膜为其支持物
3. 凝胶电泳
（1）琼脂糖凝胶电泳
（2）聚丙烯酰***凝胶电泳
三、聚丙烯酰***凝胶电泳
聚丙烯酰***凝胶电泳原理
聚丙烯酰***凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)是以聚丙烯酰***凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
1、聚丙烯酰***凝胶由单体丙烯酰***和***双丙烯酰***聚合而形成的三维网状结构，聚合过程由自由基催化完成。
2、催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
(1)在化学聚合过程中，以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四***乙二***（TEMED）为加速剂, TEMED催化AP产生自由基；
(2)在光聚合过程中，以核黄素为催化剂，光催化核黄素产生自由基。自由基引发丙烯酰***单体聚合，同时***双丙烯酰***与丙烯酰***链间产生***键交联，从而形成三维网状结构。
聚丙烯酰***凝胶的特性
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；
(3)对pH和温度变化较稳定；
(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g
(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
聚丙烯酰***凝胶电泳的分类
1. 根据其有无浓缩效应，分为：
（1）连续系统——连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应
（2）不连续系统——不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
2. 根据蛋白质样品变性与否，分为：
（1）变性电泳——也就是SDS-PAGE，蛋白质失去二三级结构；
（2）非变性电泳 ——蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
，分为：
（1）圆盘电泳
（2）板状电泳
两者电泳原理完全相同。
四、变性聚丙烯酰***凝胶电泳（SDS-PAGE）
SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰***凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素），其原理在于：
：由于SDS（十二烷基硫酸钠）产生的十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别；
：SDS能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带；
：SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A；
这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小。
SDS-PAGE的原理
四、不连续聚丙烯酰***凝胶电泳
不连续PAGE的原理
三个不连续

三个效应
凝胶孔径不同
缓冲液pH不同
缓冲液离子成分不同
浓缩效应
电荷效应
分子筛效应
不连续体系的组份
不连续体系由浓缩胶、分离胶及电极缓冲液所组成。
1. 浓缩胶是由核黄素催化聚合而成的大孔胶，-HC1。
2. 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶， Tris