实验一质粒DNA的提取.ppt

实验一 质粒DNA的提取
第一页，共二十七页。
实验目的
实验原理
实验仪器、材料与试剂
实验步骤
实验结果及讨论
第二页，共二十七页。
实验目的
了解碱法提取质粒的原理；
掌握碱法提取质粒的方法；
掌握DSDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。
第十八页，共二十七页。
5. 氨苄青霉素（Amp）
用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。
6. RNaseA
将RNA 酶 A溶于10 mmol/L (pH )、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
7. 酚/***仿(1:1)，***仿/异戊醇(24:1)，乙醇 ，75%乙醇。
第十九页，共二十七页。
实验步骤
质粒的提取
1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入1-2ml LB液体培养基（含Amp mg/ml ）中，37℃振荡培养过夜。
2. ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，弃上清液。
3. 加入100  l SolutionI，涡旋使细胞充分悬浮。
4. 加入200  l SolutionII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀（注意动作轻），冰上放置5min。
5. 加入150  l SolutionIII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀（注意动作轻） ，冰上放置5min。
第二十页，共二十七页。
6. 15,000rpm，离心10min， ml Eppendorf 管中，注意所取体积（约400  l ） 。
7. 加入等体积酚/***仿（1:1），颠倒数次混匀（注意动作轻），12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。
8. ml Eppendorf 管中，加入等体积的***仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀， 12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。
第二十一页，共二十七页。
9. ml Eppendorf 管中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min， 4℃离心，15,000rpm，10min。
10. 弃上清，加1ml 75%乙醇漂洗沉淀， 4℃离心，10,000rpm，5min。
11. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。
12. 加入50  l TE buffer，室温振荡溶解质粒DNA。
第二十二页，共二十七页。
培养细菌使质粒扩增
1. 挑取琼脂培养板上的单菌落至2ml LB培养液中（含Amp100 g/ml) 37℃摇荡培养过夜。
2. 取1ml菌液转接到一个含有100 ml LB培养液三角瓶中(含 Amp100 g/ml ）, 37℃摇荡培养过夜。
37℃
振摇过夜
37℃
振摇过夜
第二十三页，共二十七页。
Tiangen质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用）
操作过程
1. 柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500  l 的平衡液BL，12,000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2. 将1-2ml 离心管中，12,000rpm离心1分钟，并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。
3. 加200  l 溶液P1（用前检查是否已加入RNase A），重悬细菌体沉淀，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
第二十四页，共二十七页。
4. 加200  l 溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被打断，注意不要让反应持续超过5 分钟。
5. 加300  l 溶液P3，立即轻柔颠倒离心管6-8 次，充分混匀，此时溶液应该出现白色絮状沉淀。
6. 12,000rpm离心10 分钟。
如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。
7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心30-60秒，并弃去接液管内液体。
8. 向吸附柱CP3 内加600  l漂洗液PW ，12,000rpm 离心30-60 秒，并弃去收集管内废液。
9. 重复第8 步一次。
第二十五页，共二十七页。
放入收集管中，12,000 rpm 离心2分钟，目的是将吸附柱中