实验一、DNA提取
实验一DNA的小量制备
小量法提取植物基因组DNA(CTAB法)
1 实验目的:
随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用,人们经常需要提取高分子量的植物DNA,用于
实验一、DNA提取
实验一DNA的小量制备
小量法提取植物基因组DNA(CTAB法)
1 实验目的:
随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用,人们经常需要提取高分子量的植物DNA,用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等,这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学****从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法,进一步了解DNA的性质,掌握分子生物学实验的基本方法。
2 实验原理
细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内。提取DNA时,一般先破碎细胞释放出DNP,再用含少量异戊醇的***仿除去蛋白质,最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例:RNP NaCl中溶解度很大,而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1%。当NaCl 浓度逐渐增大时,RNP的溶解度变化不大,而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时,DNP的溶解度最大,为纯水中溶解度的2 倍, NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA制品,可用适量的RNase 处理提取液,以降解DNA中搀杂的RNA。
关于植物总DNA的提取主要有两种方法:
1.CTAB 法:
CTAB(十六烷基三***溴化铵,hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB):是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中()是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度( mol/L NaCl)时从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB 能溶解于乙醇中。
2.SDS 法:
利用高浓度的阴离子去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠,Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS)使DNA与蛋白质分离,在高温(55~65℃)条件下裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/***仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp,在基因克隆工作中,通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4
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