荧光定量PCR技术在物种鉴定应用中的优势附案例血浆蛋白粉鸡源鉴定.docx

荧光定量PCR技术在物种鉴定应用中的优势-附案例：血浆蛋白粉鸡源鉴定
在生物制品行业中，不同物种来源的同一生物制品价格差异较大，进而催生了利用生物制品中残留的DNA鉴定物种来源的技术。但由于现有市场上物种源性的鉴定技术主要以定性检荧光定量PCR技术在物种鉴定应用中的优势-附案例：血浆蛋白粉鸡源鉴定
在生物制品行业中，不同物种来源的同一生物制品价格差异较大，进而催生了利用生物制品中残留的DNA鉴定物种来源的技术。但由于现有市场上物种源性的鉴定技术主要以定性检测为主，导致用户收到的鉴定结果常常是一个产品中不同的物种都呈阳性，这给广大用户（特别是同一生产设备、车间生产有不同物种来源的同一生物制品的生产厂家）带来了很大的疑惑：物种DNA鉴定的方法一点都不靠谱，不准确或不灵敏。
实际上恰恰相反，由于PCR检测太灵敏了，只要有几个可作为DNA模板的分子存在，检测结果就是阳性。本实验室近期收到山东一家生产血浆蛋白粉的厂家委托的检测：他的一批猪血浆蛋白粉被鉴定为含有鸡源DNA组份，怀疑是假冒的猪血蛋白粉，希望我们提供更有价值的检测方法。
我们的建议是：请厂家提供一份纯的鸡血浆蛋白粉样本和一份被怀疑是假冒猪血蛋白粉的样本，一起用荧光定量PCR的方法鉴定其中鸡源DNA的含量，如果两者鸡源DNA测出的含量相差悬殊，应视为鸡源DNA蛋白粉的污染，而不应视为以鸡源蛋白粉假冒猪源蛋白粉。
下面小编以为用户鉴定鸡源DNA浓度为例，比较定性鉴定与定量鉴定的差别：
实验样本：鸡肉，1号血浆蛋白粉样本（鸡源），2号血浆蛋白粉样本（被怀疑是假冒猪血浆蛋白粉的鸡血浆蛋白粉）
实验试剂：动物组织DNA试剂盒（simgen，.：3101050），全血/培养细胞DNA试剂盒（simgen，.：3002050），PBS溶液（simgen，.：9004500）。
DNA提取步骤：
提取鸡肉组织的基因组DNA按动物组织DNA试剂盒说明书操作，用100µl Buffer TE 洗脱DNA。
血浆蛋白粉按以下步骤操作：
取50mg血浆蛋白粉样本溶于200µl PBS溶液，加20µl蛋白酶K混匀。
2. 然后按全血/培养细胞DNA试剂盒说明书（从全血、唾液、培养细胞、精液及革兰氏阳性菌中分离纯化总DNA）步骤二接下去操作，用100µl Buffer TE 洗脱DNA。
实验器材及差异步骤：
普通PCR定性鉴定
荧光定量PCR定量鉴定
设备
PCR仪、移液器、电泳仪、
凝胶成像仪
荧光PCR仪及电脑、移液器
试剂
PCR mix、引物
PCR mix、引物、探针
步骤
配置PCR反应体系
上PCR仪扩增
制琼脂糖凝胶
PCR产物电泳及分析结果
1. 配置PCR反应体系
2. 上PCR仪扩增
3. 扩增结束后，在电脑上分析结果
结果观察
电泳后在凝胶成像仪下观察
（见图一）
电脑上观察及分析结果
（见图二、图三）
结果分析
只能得出1号样本的鸡源DNA比2号的多
可得1号样本的鸡源DNA是2号的86倍左右
M 1 2 3 4
图一PCR电泳图