第六章工业微生物育种.ppt

诱变育种
是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变频率显著提高的基础上，从中挑选少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。
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效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位
合状态，表型才能表现出来。
生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能
表现出来。
分离性延迟的原因: 对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。
生理性延迟的原因: 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。
（四） 中间培养（CM，培养过夜）
目的：克服表型延迟
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初筛
复筛
1. 初筛（以量为主）
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性
（2）根据平板颜色反应直接挑选
透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；
抑菌圈法（抗生素）；
变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；
沉淀圈法（外***
透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标）
方法需简便、快速
2步
（五）突变株的筛选
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（3）浓度梯度法
（4）影印平板法
（5）琼脂块大通量筛选方法
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2. 复筛（以质为主，定量测定）
（1）摇瓶培养，直接检测所需产物
（2）产物活性检查
琼脂平板活性圈法
纸片法
琼脂薄层纸片法
（3）复筛数据的调整
菌落、菌体形态观察进一步筛选突变株；
培养基和条件的调整；
菌株纯度及遗传特性进行研究
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二、诱变育种的基本原则
选择简便有效的诱变剂；
挑选优良的出发菌株；
处理单细胞或单孢子悬液；
选用最适的诱变剂量；
充分利用复合处理的协同效应；
利用和创造形态、生理与产量间的相关指标；
设计高效筛选方案；
创造新型筛选方法。
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1. 抗性突变株的筛选
(1) 抗终代谢物结构类似物突变株的筛选
用途：筛选相应代谢物的高产菌株
三、几种重要突变株的筛选方法
结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质。
如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。
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（2）抗药性突变株
用途：筛选相应药物(抗生素) 的高产菌株或遗传标记制作
筛选的方法:
a. 高于临界浓度的平板进行分离；
b. 梯度平板法
敏感菌苔
抗性菌落
加入含异烟肼的上层
加入不含异烟肼的底层
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（1）几个概念：
基本培养基（MM ）[-]：某野生型能生长的最低成分的组合培养基。
完全培养基（CM）[+]：各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基
补充培养基（SM）[A]:[-]+A，[B]:[-]+B
相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
2. 营养缺陷型突变株的筛选
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三种遗传型：
野生型（wild type）
从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。[A+B+], 可在[-]生长。
营养缺陷型（auxotroph）
野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。
[A+B-]：能在[+]、[B]生长
[A-B+]：能在[+]、[A]生长
[A-B-]：能在[+]生长
原养型（prototroph）营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求
[A+B+], 可在[-]生长
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（2）筛选步骤（5步）
诱变处理
中间培养
淘汰野生型
检出缺陷型
鉴定缺陷型
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①中间培养