索莱宝质粒小提试剂盒使用方法.doc

用接种环在酒精灯火焰上烧红灭菌并冷却后，从细菌平板上挑取单个菌落，在装有2~3ml的LB培养基的中试管中接种，37℃摇床震荡培养12小时。也可以直接从保种的液体菌种中刮取少量细菌，接种到中试管中，同样，37℃振荡培养12小时。
使用前先将用接种环在酒精灯火焰上烧红灭菌并冷却后，从细菌平板上挑取单个菌落，在装有2~3ml的LB培养基的中试管中接种，37℃摇床震荡培养12小时。也可以直接从保种的液体菌种中刮取少量细菌，接种到中试管中，同样，37℃振荡培养12小时。
使用前先将漂洗液中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上标签。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2~8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。
注：菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。
向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液Ⅰ（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或漩涡震荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
向离心管中加入250ul溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注:混匀一定要温和，以免为细菌基因组DNA污染，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。
向离心管中加入350ul溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min。
注：溶液Ⅲ加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
向吸附柱中加入700ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否侧漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。
将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置1min，12000rpm离心1min。
为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置1min，12000rpm离心1min。
质粒可以在-20℃冰冻长期保存。
注意事项：
使