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DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍.doc


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双脱氧链终止法又称为Sanger法
原理是:核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种单脱氧核甘三磷酸(dNTP,其 中的一种用放射性P32标记)存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例 引入4种双脱氧核甘三磷酸(ddNTP),因为双脱氧核甘珠上。每一个磁珠携带一个 单链DN***段。随后扩增试剂将磁珠乳化,形成油包水的混合物,这样就形成 了许多只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
扩增每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增(乳液PCR),从 而排除了其它序列的竞争。整个DN***段文库的扩增平行进行。对于每一个片 段而言,扩增产生几百
万个相同的拷贝。乳液PCR终止后,扩增的片段仍然结合在磁珠上。
4)测序 携带D NA的捕获磁珠被放入PTP板中进行测序。PTP孔的直径(29 |im
)只能容纳一个磁珠(20 pm) o放置在4个单独的试剂瓶里的4种碱基, 依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板,每次只进入一个碱基。如果 发生碱基配对,就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和荧光素酶 的作用下,释放出光信号,并实时地被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一 个碱基和测序模板进行配对,就会捕获到一分子的光信号;由此一一对应,就可 以准确、快速地确定待测模板的碱基序列
与其它第二代测序平台相比,454测序法的突出优势是较长的读长,目前GS FLX测序系统的序列读长已超过400 bp o虽然454平台的测序成本比其他新一 代测序平台要高很多,但对于那些需要长读长的应用,如从头测序,它仍 是最理想的选择。
Solexa测序技术
Illumna公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发,利用合 成测序(Sequencing by Synthesis)的原理,实现自动化样本制备及大规模平行测 序。Genome Analyzer技术的基本原理是将基因组DN A打碎成约100-200个碱 基的小片段,在片段的两个末端加上接头(adapter)。将DN***段变成单链后 通过接头与芯片表面的引物碱基互补而使一端被固定在芯片上。另外一端随机和 附近的另外一个引物互补,也被固定住,形成桥状结构。通过30轮扩增反应, 每个单分子被扩增大约1 000倍,成为单克隆的DNA簇,随后将DNA簇线性 化。在下一步合成反应中,加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的d NTPo在DNA合成时,每一个核甘酸加到引物末端时都会释放出焦磷酸盐,激 发生物发光蛋白发出荧光。用激光扫描反应板表面,在读取每条模板序列第一轮 反应所聚合上去的核甘酸种类后,将这些荧光基团化学切割,恢复3,端黏性,随 后添加第二个核甘酸。如此重复直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样, 统计每轮收集到的荧光信号结果,就可以得知每个模板DN***段的序列 Genome Analyzer系统需要的样品量低至lOOng ,文库构建过程简单,减少了样 品分离和制备的时间,配对末端读长可达到2X50bp ,每次运行后可获得超过 20 GB的高质量过滤数据,且运行成本较低,是性价比较高的新一代测序技术。
SOLiD测序技术
SOLiD 全称为 Supported Oligo Ligation Detetion ,是 ABI (应用生物系统)公 司于
200

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  • 上传人小健
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  • 时间2022-05-20