考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
一、目的
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一,承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础,也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
一、目的
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一,承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础,也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质,提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法,简便快捷,灵敏度高,稳定性好,是一种较好的常用方法。通过本实验学****考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理,了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理
考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、仪器、试剂和材料
1.仪器
(1)分析天平
(2)具塞刻度试管 10ml× 8
(3)吸管 ×I,lml×Z,5ml×I
(4)研钵
(5)漏斗
(6)离心管 10ml
(7)容量瓶 10ml
(8)离心机
(9)721型分光光度计
2.试剂
(1)标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100ml,制成 100 pg/ml的原液。
(2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml 90%乙醇中,加入 85%(m/v)的磷酸 100ml,最后用蒸馏水定容到 1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。
3.材料
绿豆芽
四、操作步骤
1.标准曲线的制作 取6支具塞试管,编号后,按下表加入试剂。
管 号
操作项目
1 2 3 4 5 6
标准蛋白质溶液(ml)
0 0. 6
蒸馏水(ml)
0
G-250试剂(ml)
各5
蛋白质含量(μg)
0 20 40 60 80
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