核酸和蛋白质分析技术
精选课件
第一节 核酸分析技术
讲述内容:
1、核酸电泳
2、杂交技术
3、PCR技术
4、基因芯片
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一、核 酸 电 泳
(一)DNA的凝
非放射性:生物素、***素、荧光素
2、标记方法
(1)切口平移法
(2)随机引物法
(3)末端标记法
(4)单链DNA探针标记
(5)寡核苷酸探针标记法
32P、35S和3H
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三 PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物,通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环,使目的DN***段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的,经25-30个循环后,扩增倍数可达106。
Dr. Karry Mullis 1985年发明,获1993年度诺贝尔化学奖;
目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。
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(一)原理:
双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA ---变性
↓
与一对寡核苷酸引物(5’, 3’)降低温度退火
DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合,形象地称为退火
↓
适温延伸5’/3’引物形成新链变成4条链DNA --延伸
↓
第二轮:变性—退火—延伸
呈指数增长
理论值:一轮一倍 10轮 103=1000倍
20轮 106
30 轮 109
理论 模板扩增30轮 1ng-----------1g
实际 模板扩增30轮 1ng-----------10g
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1 Taq DNA聚合酶:
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶
①5’3’DNA聚合酶活性;
②无3’5’外切酶活性,
%错配,与原始模板有差别;
最适聚合酶 温度72℃,选择72℃延伸
半衰期:℃ 130min
95℃ 40min
℃ 5—6min
变性温度:≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性
(二)基本要素
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pfu DNA 聚合酶
耐热
5’3’DNA聚合酶活性
3’→5’外切酶活性
精确度:pfu >Taq
但pfu扩增效率通常比Taq酶略差
文献报道:Taq+pfu 会起到较好效果
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2 .引物
人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃,
Tm值要相近,每条10-50pmol /100l
◆设计原则:
(1)靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同
3'下游Primer与双链DNA正链互补,与负链相同
正链5'————— 3' ——上游Primer
——下游Primer 负链 3'————— 5'
例如:
IL-3正链
5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3'
负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5'
上游~: 与其相同
下游~: 先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'
所以负链Primer:5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3'
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(2)Primer 本身不要出现内部互补序列
形成loop环,内部二级结构
如: GGGTCGATTCCTACCCATGC
(3)注意减少Primer间互补序列
导
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