核酸提取及常见问题.ppt

DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
CTAB法
　SDS法
　其它
精选课件
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammonium b差速离心法原理
是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
精选课件
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、
　　　　　原因分析及其对策
内容
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见
问题、原因分析及其对策
第二部分：DNA提取常见问题、
　　　　　原因分析及其对策
精选课件
DNA提取的基本步骤

－内容物释放
、纯化
，并去除杂质
 

精选课件
材料准备
最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融
提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）
组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解
含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）
培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失
尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量
菌株不要频繁转接（质粒丢失）
精选课件
细胞裂解
材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低
针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
植物材料－－液氮研磨
动物组织－－匀浆或液氮研磨
组培细胞－－蛋白酶K
细菌－－溶菌酶破壁
酵母－－破壁酶或玻璃珠
高温温浴时，定时轻柔振荡
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
菌体量适当
培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮
变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断
复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染
G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁
精选课件
核酸分离、纯化
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系
采用有机（酚/***仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔
离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
精选课件
核酸分离、纯化
蛋白质的去除：
酚/***仿抽提
使用变性剂变性（SDS、异硫***酸胍等）
高盐洗涤
蛋白酶处理
精选课件
多糖的去除：
高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
用多糖水解酶将多糖降解。
在提取缓冲液中加一定量的***苯(1/2体积)，***苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。
用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 ( M NaCl) ，冰浴20min。
核酸分离、纯化
精选课件
多酚的去除：
在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等
加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合
核酸分离、纯化
盐离子的去除：
70％的乙醇洗涤
精选课件
核酸沉淀、溶解
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分
沉淀时加入1/10体积的NaAc（，3M），有利于充分沉淀
沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等
晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）
若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
，可防止DNA发生酸解
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
精选课件
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质
DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应
DNA中残留有金属离子
重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）
重新沉淀DNA，让酒精充分挥发
增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原因
对
策
精选课件
材料