《蛋白质分离纯化》.ppt

蛋白质的分离、纯化
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研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。
(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；
(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。
(3)分离和纯化过程都必须在温部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该pH 的蛋白质仍然留在溶液中。
该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。
(1)沉淀法
等电点沉淀法
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蛋白质的纯化方法
Dialysis此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。
常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。
（2）膜分离法
 透析法
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蛋白质的纯化方法
透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。
通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。
（2）膜分离法
 透析法
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蛋白质的纯化方法
超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。
其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器板式超滤器。
（2）膜分离法
超过滤法
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蛋白质的纯化方法
离子交换层析法
（3）层析法
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蛋白质的纯化方法
此法又称为分子筛层析（gel-filtration chromatography） 。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰***形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。
Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200
Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6B
Sephacryl-丙烯酰***葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400
凝胶过滤法
（3）层析法
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分子筛层析（gel-filtration chromatography）
原理
基质 葡聚糖凝胶（sephadex）
琼脂糖凝胶（sepharose）
应用 测定分子量 : lgMr=a-bVe
脱盐和浓缩
分离提纯生物大分子
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这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。
选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中。
当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。
③亲和层析法
（3）层析法
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亲和层析（affinity chromatography）
应用 分离纯化酶、 抗原、抗体
分离纯化核酸
研究酶的结构与功能
+
待纯化分子
配体
a. 待纯化分子和配体间具有亲和性
+
基质
b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂
+
+
杂质
c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离
+
d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子
原理：
基质 纤维素、聚丙烯酰***凝胶、
sepharose、sephadex
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蛋白质的纯化方法
在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质溶液的pH值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同。
在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。
（4） 电泳法
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蛋白质的纯化方法
SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1  2比例结合。
这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，Eq值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。
用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。
（4） 电泳法
SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳法
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离心技术
1．离心机类别
普通离心机 6000转/分