hits-clip步骤.doc

第一天: 1. 细胞培养在 100或 150m m 的平板上,用 PB S 漂洗,然后 place in Stratalinker with the cover off 。以 400 mJ/cm 2 照射一次和 additional 200 mJ/cm 2 in Stratalinker 。 2. 收集细胞悬液, 4℃下 2500rpm 离心细胞团 5min ,3 (~3x dry volume) 倍细胞沉淀体积的 PBS 重悬细胞团,每个 eppie 加入 1ml 的细胞悬液,在 4℃下快速离心,去上清,然后保存在-80 ℃备用(每管大约 200 μl 细胞)。备注: 1× HBSS : 50ml 10× Hank ’s 平衡盐溶液, Ca-Mg-free(Gibco, #14186-012) 5ml 1M HEPES, 445ml ddH 2O 第二天: II .免疫沉淀 a. 溶液(现用现配) 1× PXL ( wash buffer ) 1× PBS ( 组织培养等级 tissue culture grade ; 不含 Mg 2+, Ca 2+) % SDS % 脱氧胆酸盐 % NP-40 5× PXL ( 高盐 wash buffer ) 5× PBS ( 组织培养等级; 不含 Mg 2+, Ca 2+) % SDS % 脱氧胆酸盐 % NP-40 1× PNK 缓冲液 50 mM Tris-Cl pH 10 mM MgCl 2 % NP-40 1X PNK+EGTA Buffer 50 mM Tris-Cl pH 20 mM EGTA % NP-40 b. Bead 的制备: 每一 Eppie 的交联裂解液使用 400 μl 的蛋白 A 免疫磁珠(Dynal, ) 用 pH 的 M 的磷酸钠溶液洗小珠三次。(这里使用高 pH 是因为能增加蛋白 A对抗体的结合。然而这需要所有免疫沉淀的缓冲液应该适用于你所用的抗体。例如, 我们发现有些抗体在缓冲液中不与脱氧胆酸盐作用。) 用 350 μl的 pH M 磷酸钠重悬小珠,加入 50μl桥联 Ab ( l; 兔抗鼠 IgG )。在室温旋转试管 45min ;用 pH 的 M 磷酸钠洗三次。在 400 μl pH M 磷酸钠溶液中重悬小珠,加入3μl的 2A 8或 12μl的 7G1-1*ascit e 液体( 5mg/ml )。 4°C下旋转试管 4 小时,1× PXL 洗三次; 如果你不准备加入交联裂解液, 在最后一步移去小珠 leave beads in last wash step 。 c. RL3 (-P) 接头(不含 P 磷)对 5’末端的标记。(在做IP 之前或过程中制备5’末端标记的接头。用预标记的3’接头做 AGO HITS-CLIP , 发现在放射自显影图中比免疫沉淀后 PNK 反应标记分离得到的 RNA 有更多特异性信号。) μl RL3(-P) 接头(50pmol/ μl;5’端不含磷酸) 5μl 10× PNK Buff er (NEB) 25μl 32 P-γ-ATP 8μl T4 PNK en