pET表达系统.ppt

pET 表达系统的原理 Nanjing Normal University pET 表达系统的原理强大、灵活的强大、灵活的 pET pET 表达系统表达系统使用乳糖或乳糖类似物进行诱导表达,表达的时机完全由人为决定,可控性强。非诱导培养条件下,采用一定的措施可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。充分诱导时,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白;诱导表达后仅几个小时, 目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50% 以上。可控制的表达低本底的表达高效率的表达 Nanjing Normal University 内容介绍乳糖操纵子的正负调控 T7 RNA 聚合酶 pET 表达系统 123 Nanjing Normal University 乳糖操纵子的结构 operator lac operon IPO ZYA Lac I 阻遏蛋白 Lac I 阻遏蛋白β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷酶 Lac 通透酶 Lac 通透酶 Lac 乙酰转移酶 Lac 乙酰转移酶 Nanjing Normal University 乳糖操纵子的负调控 IPO ZYA I mRNA I mRNA 翻译出的阻遏蛋白结合到启动子部位, 阻止 lac 操纵子基因的转录 IPO ZYA I mRNA lac mRNA 诱导物与阻遏蛋白结合使阻遏蛋白无法与启动子结合,转录顺利进行,表达相应的酶诱导物存在时诱导物不存在时诱导物诱导物 Nanjing Normal University 乳糖操纵子的正调控 IPO ZYA lac mRNA 在细菌饥饿时,胞内的 cAMP 浓度会上升,与 CAP 结合促使后者活化。蛋白复合体可以结合到 lac 启动子区域,提高启动子的转录效率。诱导物诱导物 cAMP CAP Nanjing Normal University lacUV 5 与 cAMP -CAP 复合体的亲和能力大大降低在没有 cAMP -CAP 复合体的情况下能更好的转录 lac lac lacUV lacUV 5 5 只受 lacI 阻遏蛋白调控 Nanjing Normal University T7 RNA 聚合酶?λ(DE3) 噬菌体,单链蛋白。?只识别λ噬菌体启动子,不识别大肠杆菌启动子。?噬菌体启动子不能被大肠杆菌 RNA 聚合酶识别。? RNA 的合成速度是大肠杆菌 RNA 聚合酶的 5倍来源来源专一性专一性转录效率转录效率 Nanjing Normal University pET 系统表达原理 lacUV5 T7 RNA Polymerase gene 基因组 pET 目标基因 T7 启动子 lacI 阻遏蛋白未诱导的情况下 Nanjing Normal University pET 系统表达原理 lacUV5 T7 RNA Polymerase gene 基因组 lacI 阻遏蛋白诱导的情况下 pET 目标基因 T7 启动子乳糖或 IPTG