DB37T36732019牡蛎疱疹病毒制型检测技术规范巢式PCR法.doc

ICS
B 41
DB37
山 东 省 地 方 标 准
DB 37/T 3673—2019
牡蛎疱疹病毒I型检测技术规范 巢式PCR
法
Ostreid herpesvirus-1 Detection Speci直接购买市售产品。
4. 1. 15 MgCL (25 mmol/L):生化试剂，-20 °C保存。
4. 1. 16 Taq DNA聚合酶(5 U/ u L)：生化试剂，-20 °C保存。
4. 1. 17 外引物 CF： 5' -ATTACCCAGATTCCCCTC-3, , -20 °C保存。
4. 1. 18 外引物 CR： 5' -CCACAAATGTAAACTGTGAC-3' , -20 °C保存。
4. 1. 19 内引物 C3： 5' -GTGTTCTATACCATACGACCTACA-3' , -20 °C保存。
4. 1. 20 内引物 C2： 5' TTGCGTTCCGTGACTTCT-3' -20 °C保存。
PCR检测阳性对照：己知受牡蛎疱疹病毒I型感染的贝类组织样品，-80 °C保存。
PCR检测阴性对照：已知未受牡蛎疱疹病毒I型感染的贝类组织样品，-80 °C保存。
PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。
：分析纯。。
4. 1. 25 6 X Loading Buffer：,也可以直接购买市售产品。
4. 1. 26 DNA分子量标准。
4. 1. 27漠化乙锭(EB):分析纯，10 mg/mL,见A. 10,或其他等效产品。

4. 2. 1 离心机。
4. 2. 2 PCR 仪。
4. 2. 3电泳仪。
4. 2. 4水平电泳槽。
4. 。
4. 。
4. 2. 7水浴锅或金属浴。
4. 2. 8 -20 °C普通冰箱。
4. -80 °C超低温冰箱。
4. 2. 10微波炉电炉或其他加热设备。
4. 2. 11微量移液器： uL〜1 000 uL»
5采样
1采样对象
牡蛎、扇贝和魁蛆等易感双壳贝类。
、方法和保存运输
采样数量、方法和保存运输应符合SC/T 7205. 1的要求。

稚贝(附着后〜2 mm)和幼贝(2 mm〜3 cm)取内脏团；成贝(>3 cm)取外套膜和斧足。
mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于-20 °C。
6检测
1 DNA的提取
6. 1. 1取30 mg~50 mg组织样品，加入抽提缓冲液500 uL,充分研磨，37 °C温浴1 h。提取过程同 时设置阳性对照、阴性对照、空白对照。
6. 1. uL 20 mg/mL蛋白酶K,至终浓度100 Ug/mL,混匀后置于50 °C水浴3 h,不时旋 动。
，加入等体积平衡酚，颠倒混合10 min,于10 000 r/min离心3 min分离 两相。
6. mL离心管中，加入等体积酚/***仿/异戊醇(25:24:1),颠倒混合10 min,于10 000 r/min离心1 min分离两相。