小鼠肾脏原代细胞的分离和计数.doc

一小鼠肾脏原代细胞的分离及细胞计数(一) 原理细胞培养(Cell culture) 是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出, 在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代, 进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来, 广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域, 发展成一种重要生物技术, 并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短,性状与体内相似,适用于研究。一般说来, 幼稚状态的组织和细胞,如: 动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。(二) 操作 1 .取材用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。然后,把整个动物浸入盛有 75% 乙醇的烧杯中数秒钟消毒, 取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤, 剖腹取出肾脏。置于无菌平皿中。 2 .切割用灭菌的 PBS 液将取出的脏器清洗三次,然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎, 直到成 1 mm 左右的小块, 再用 PBS 清洗, 洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中, 静置数分钟, 使组织块自然沉淀到管底,弃去上清。 3 .消化吸取 %胰蛋白酶一 % EDTA 混合消化液 1 ml ,加入离心管中,与组织块混匀后,加上管口塞子, 37℃水浴中消化 30 分钟,每隔 5 分钟摇动一下试管, 使组织与消化液充分接触, 静止, 吸去上清。 4. 制备单细胞悬液向含有经消化的肾组织的离心管中加入 2-3 ml PBS ,用吸管吸打数次,直到看不到块状组织。 5 .细胞计数 1 盖好盖玻片: 取一套血球计数板, 将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 2 将细胞悬液滴入计数板: 将待测细胞悬液吹均匀, 然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入, 要保证盖片下充满悬液, 注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。 3 统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察, 并移动计数板, 当看到镜中出现计数方格后, 数出四角的四个大格(每个大格含有 16 个中格)中的细胞数目。 4 计算原细胞悬液的细胞数( 按照下面公式计