植病研究技术分子生物学.ppt

植病研究技术
李向东 原雪峰 刘爱新
植物保护学院植物病理学系
2013-2014第一学期
课程安排
分子生物学 原雪峰 6学时
血清学技术 李向东 3学时
病毒学 溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---生物大分子的分离纯化
核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异，物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。
应该去除的污染物主要包括三个部分:即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。
非核酸大分子污染物主要包括蛋白质，多糖和脂类物质等；
非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；
在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---生物大分子的分离纯化
核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
(三)核酸质量与提取步骤的关系一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---生物大分子的分离纯化
核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
(四)核酸的浓缩，沉淀与洗涤沉淀是核酸浓缩最常用的方法，核酸沉淀后，可以改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。
加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠，醋酸钾，醋酸铵，***化钠，***化钾及***化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇，异丙醇和聚乙二醇。
核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---生物大分子的分离纯化
核酸的分离纯化 （DNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）:
原理：
植物组织中绝大部分是核 DNA ,它和组蛋白、非组蛋白结合在一起,以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内.
CTAB( 十六烷基三***溴化铵, hexadecyltrimethylammonium bromide ,简称 CTAB) 是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中 ( NaCl) 是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度 ( NaCl) 时从溶液中沉淀,通过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将 CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀, CTAB 能溶解于乙醇中.
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---生物大分子的分离纯化
核酸的分离纯化 （DNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）:
在 DNA 提取过程中必须始终注意以下几个关键问题: (1) DNA 的二级结构和双链易受多种因素（如强酸/碱、加热、低盐、有机溶剂、酰***类等）的影响引起双链解开,即“变性”,因此抽提时避免使用变性的条件. (2)抑制内外源 DNase 的活力. 方法：a 、低温操作； b 、调节 pH ,使偏碱()； c 、抽提液中加表面活性剂； d 、加螯合剂(EDTA)除去酶的铺助因子(Mg2+),使酶活性丧失. (3),会使 DNA 降解,一般综合考虑,取 左右为宜. (4), DNA 分子特别大,极易被机械张力拉断,甚至在细管中稍急一些的流动也会使 DNA 断裂