兽医生物制品学第四章生物制品生产基本技术.ppt

第四章 生物制品生产基本技术
第一节 菌种与毒种选育技术
一、生物制品毒种的标准
生物学性状明显，历史清楚：形态、生理、生化典型、血清学、来源、代数等清楚。
遗传学纯一稳定：稳定纯一的菌种，才能制造出高质量稳定的疫苗。进行培养，用不同的培养方法（需要氧气，微需氧，厌氧。另培养温度，pH，渗透压等。）。
二、细菌培养的基本技术
步骤：先分离出单个菌落→斜面培养基→生化或血清鉴定→菌种保存→生产生物制品→先接种到斜面菌种→小三角瓶肉汤→大三角瓶肉汤。
（一）细菌分离培养（目的是稀释病料，得到单个典型菌落）。
1、需氧菌分离培养：分段划线、倾注培养。
2、微需氧培养：鸭疫巴氏杆菌，牛布氏杆菌病，猪传染性胸膜肺炎菌等，用蜡烛缸方法。3、厌氧菌培养：用疱肉基，物理除氧气（加氮气，氢气），化学除氧：焦性没食子酸加烧碱。
厌氧罐
厌氧培养箱
（二）细菌的规模培养
生物制品是产品，一般要大规模培养，才能满足基层需要。
1、菌种接种量：1-3%，过少生长慢，过度带入有害产物多，影响生长。
2、培养时间：菌苗，对数期和稳定期的细菌好；芽孢疫苗：衰老期细菌；外***：需要1周时间培养。在培养过程中，如果有少量污染，可以提前灭活终止培养。
②液体静止培养：一般细菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）或发酵罐，装入培养基1/2—-2/3量，需氧培养，要5小时摇动一次，增加氧气浓度。培养厌氧细菌，可以装满培养基，上面加少量石蜡油，隔绝空气，下加肝块或肉渣（疱肉基），它们氧化，吸收氧气，达到除氧气目的。液体培养含菌量低，多需要浓缩。
3、培养方法：根据不同制品的性质和要求，选育不同方法。
①固体表面培养：多用于诊断剂，也有菌苗生产。可随意调节细菌浓度，但操作麻烦，劳动量大。
培养方法有克氏瓶，大平皿，到入菌液，L玻棒刮抹接种，培养后加生理盐水，再用L棒刮洗下细菌混悬液。
③液体深层通气培养（发酵罐）：可自动调节温度、氧气、pH、营养、搅拌，注意消泡沫和污染。
④透析培养：半渗透膜作用，营养可以不断补充，可以提高细菌和***含量。
⑤连续培养：营养不断加入，培养好的细菌不断流出。
KRH-PB-6L 玻璃发酵罐
（三）细菌计数技术
细菌疫苗必须有一定含菌量，才有好的免疫效果。所以，应该对生产的疫苗计算含菌量。
1、直接显微镜检查计数
①定量定面积染色计数：10ul菌液，涂抹1cm2面积的载玻片上，干燥固定染色，油镜下观察，油镜直径是0、16mm，视野面积是0、02mm2，1cm2面积有50万个油镜视野，多观察几个视野，算出一个视野细菌平均数X50万X100，即每ml含细菌量。
②比例法计数（也叫对照法）
如用已知人红细胞为500万/mm3（可以把红细胞0、4%甲醛固定，长期使用），取一环红细胞放在载玻片上，另取一环菌液与红细胞混匀涂片，干燥固定染色，显微镜下检查，如果平均每个视野是一个红细胞，10个细菌，那么，被检查细胞为5000万/ mm3，，1ml是500000万个细菌。
③估计计数法
，取一环细菌液，涂抹在载玻片上，—1 cm2，干燥固定染色，显微镜检查，如果每个视野平均是1—9个细菌，菌液含量是105-6个/ml，10—99为107-8个/ml，100以上为109-10个/ml，密不可计为1010个以上/ml。
④红细胞计数室法：
（细菌量）Y/80X400X稀释倍数X10=细菌数/ mm3，变ml乘1000。（Y是5个中方格细菌总数，乘10是计数室的高度为0、1mm，计数室1mm2，有400个小格，有25个中格，每个中格是16个小格）。该方法多用于计数大的细菌或酵母菌、细胞。
2、比浊比色法
①比浊管法 含菌量与浑浊度正比，用已知菌含量的试管与标准比浊管相比，找出规律，如1亿细菌=1号比浊管颜色，10亿等10号，以后，用未知细菌液与标准管比色，得出大致细菌含量。
②美蓝还原褪色法：含细菌多，使美蓝褪色快。10ml牛奶，加1ml美蓝液（1/3000），37度水浴，褪色少于20分钟，细菌多于2000万/ml，20-2小时，为400—2000万；2----5、5小时为50—400万；5、5小时以上，为少于50万/ml，为一级牛奶；如果用于细菌苗，应先用已知细菌找出规律。
3、活菌计数：
原理，一个菌落是一个细菌的后代，数菌落就知道含菌量，也叫菌落形成单位—CFU：colony format unite。
①倾注法（GB方