分子生物学C11基因分析的基本策略.ppt

第十一章基因分析的基本策略
基因操作——所有涉及到DNA或者RNA操作的技术，或者指所有基因工程和基因工程相关技术
基因分析
基因功能的研究
基因分析的构思
了解基因的组成——基因的DNA序列测定
利用比较基因组学，比较不同生物基因组和基因序列
通过逐一阅读基因的DNA序列，可以准确地发现突变位点和突变碱基
（四）通过DNA序列测定分析人工重组的基因
（五）通过DNA序列测定对定点突变 进行确认
Southern blot
PCR
Real-time PCR
代表性寡核苷酸阵列分析
二、Southern 杂交和PCR等技术可 分析基因拷贝数的变化
（一） Southern blot 可以检测基 因拷贝数的变化
Southern blot: 基因是DNA分子，如果基因拷贝数发生变化（增多或减少），但基因序列没有改变，就可以根据基因序列合成探针，利用同源互补序列可以退火形成异源双链的原理，探测染色体上能与探针结合的DNA序列。
Southern Blot 的基本过程
Isolate Genomic DNA
Digest Genomic DNA w/ Various Restriction Enzymes
Agarose Gel Electrophoresis and Southern Transfer
Make Non-Radioactive Probe
Hyribidize Probe to Southern Blot
Washes and Chemiluminescent Detection
Data Analysis
Theoretical Basis of SouthernHybridization and Washing
Prehybridization: to block portions of membrane where there is no bound DNA. This will prevent probe from binding to membrane.
Hybridization: Heat denatured probe added to prehybridization solution and incubated overnight. Conditions optimized to allow probe to bind to complementary sequences on membrane.
Theoretical Basis of SouthernHybridization and Washing
Washing: to removes non-specifically bound probe molecules.
Variables that affect stringency of washes include: salt concentration, temperature, and SDS concentration
Theoretical Basis of Chemiluminescent Detection
Blocking: performed with BSA to prevent non-specific binding of antibody
Antibody Wash: antibody binds to DIG portion of DIG-dUTP incorporated during amplification of PEPCK gene probes
Chemiluminescent Detection: phosphatase enzyme conjugated to anti-DIG antibody reacts with substrate emitting photons of light when phosphate is removed
基因组酶切消化
选择基因内部不含相应位点的限制性内切酶用于消化基因组DNA，保证基因序列完整
选择能将基因组DNA切成各种长度的DN***段的内切酶
探针标记——探针序列和信号的选择
特定基因的重复性发生在哪些序列
基因中哪些序列是保守性高的
探针序列的长度
过长：容易打弯，不利于与模板DNA结合
(二) 采用PCR技术也可以分析基因拷贝数
PCR原理
作为引物的一对寡核苷酸与模板DNA同源序列按照碱基互补配对原则形成局部双链，然后在Taq DNA聚合酶作用下引导新链DN