鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究.doc

鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究
　　鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究
　　神经生长因子〔nervegthfatr，NGF〕是神经系统最重要的生物活性分子之一，可以促进神经元的分化，维持神经元的存活[1]。鼠神经生长因子NG鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究
　　鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究
　　神经生长因子〔nervegthfatr，NGF〕是神经系统最重要的生物活性分子之一，可以促进神经元的分化，维持神经元的存活[1]。鼠神经生长因子NGF是一种从小鼠颌下腺别离出来的非共价键连接的多聚体蛋白。其生物学活性表如今能维持神经节细胞存活、诱导外周神经节外周突起生长[2]。鼠神经生长因子的生物学活性测定是其构造和功能研究的基矗目前，国际上用于NGF活性测定的方法主要有2种，即鸡胚背根神经节培养法和P12细胞〔Phehrytaells，大鼠肾上腺嗜铬细胞〕培养法[3-4]。由于细胞培养法对操作人员的经历、细胞库管理、细胞培养环境、检测仪器等方面要求较高且设备设施投入大，故国内神经生长因子生物学活性测定的方法还是主要以鸡胚背根神经节培养法为主。但是鸡胚背根神经节培养法也存在干扰因素多，实验结果重复性较差的现象，故该文通过对鸡胚运输温度控制、神经节别离和接种时间限制、培养结果观察时间探索、活性测定的浓度范围、重复性等试验，建立了一个简单、稳定、重复性好的鼠神经生长因子生物学活性的测定方法，有效地为鼠神经生长因子的消费过程监控和产品质量断定提供根据。
　　1仪器与试剂
　　
　　2培养箱，解剖显微镜，超净工作台、，倒置显微镜等。
　　
　　鸡胚：购于珠海东坑鸡场的石歧鸡种蛋；鼠神经生长因子样品：丽珠集团丽珠制药厂自制；鼠神经生长因子标准品：来自中国药品生物制品检定所，1000Au/支；DE：购于INVITRGEN公司；鼠尾胶本文由论文联盟搜集整理：丽珠集团丽珠制药厂自制。
　　2实验方法
　　
　　取自制鼠尾胶原均匀涂布于培养瓶中。将残留液吸尽后，于37℃生化培养箱中枯燥。在接种神经节前，培养瓶先用DE培养基浸洗，接种前将DE培养基倒荆
　　
　　取DE1包，，L-谷氨酰***，，加青霉素1000U、链霉素10000U，用碳酸氢钠调节pH=，无菌过滤使用。
　　
　　取孵育7～9d鸡蛋，于超净台中，取出鸡胚置于无菌培养皿中。于解剖显微镜下，从脊柱两侧别离出背根神经节，接种置培养瓶中。每瓶至少3个，于2培养箱中，37℃、5%2条件下温育至少1h。
　　
　　样品组〔共6个培养瓶〕每瓶分别参加含逐级3倍稀释的不同终浓度鼠神经生长因子的DE培养基各3L；标准品组〔共5个培养瓶〕每瓶分别参加含逐级3倍稀释的不同终浓度鼠神经生长因子标准品的DE培养基各3L；阴性对照组参加DE培养基3L。将培养瓶放入2培养箱中，37℃、5%2条件下培养24h。
　　
　　在倒置显微镜下观察，用电子目镜拍摄。依神经节突起生长不同程度分为5个等级。神经节突起生长4个象限、呈树杈状为++++；神经节突起生长3个象限、呈树杈状为+