《cr技术原理》.ppt

第五章 PCR技术原理
编辑ppt
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase
chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的
方式，在体 早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。
编辑ppt
总体积 50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
5、反应体系
编辑ppt
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂
10mM Tris·HCl （ -）， MgCl2，
50mM K+
②dNTP（底物）：等摩尔浓度的 4 种 dNTP（即 dATP、
dTTP、dCTP和dGTP），
终浓度一般为 200mM（即饱和浓度），
dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。
③引物： 1μM/L
编辑ppt
引物设计的一般原则
① 长度：至少 16bp ，通常为 18-30bp。
更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。② 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5℃ 。
对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即
Tm=4（G+C）+2（A+T）。 对于 14-70 个核苷酸的引物可用
以下公式计算。
Tm=+（1g[K+]）+（G+C）%-（675/N）    N 表示引物的核苷酸数目， [K+] 表示单价离子即钾离子的浓度
③ 避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的
3’端）。④ G+C 含量：尽量控制在 40% 至 60% 之间， 4 种碱基的分布应
尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3‘ 末
端的重复排列。⑤ 引物的 3' 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。
编辑ppt
④模板：单、双链DNA均可。
模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过
高会导致反应的非特异性增加。
⑤DNA聚合酶：
最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。

Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
编辑ppt

1）高度的灵敏性
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
PCR产物每轮循环增加一倍
编辑ppt
2 ）特异性
引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。
引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
引物
引物
编辑ppt
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。
通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。
编辑ppt
4 ）用途广泛
生命学科
医学工程
遗传工程
疾病诊断
法医学
考古学
编辑ppt
1. 长片段DNA的PCR扩增
常规PCR长度为2kb以下。
长片段PCR扩增存在的问题：
（1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低
（2）高温会损坏模板DNA和PCR产物
（3）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解
（4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合酶与模板DNA的趋近和接合变得困难
（5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制产物的长度
二、PCR的类型
编辑ppt
改进：
(1)改进缓冲体系
(2) 采用混合DNA聚合