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小鼠γ干扰素(IFN- γ) 说明书小鼠γ干扰素(IFN- γ) 酶联免疫分析( ELISA ) 试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的:本试剂盒用于测定小鼠血清, 血浆及相关液体样本中γ干扰素(IFN- γ) 含量。实验原理: 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠γ干扰素(IFN- γ) 水平。用纯化的小鼠γ干扰素(IFN- γ) 抗体包被微孔板, 制成固相抗体, 往包被单抗的微孔中依次加入γ干扰素(IFN- γ) ,再与 HRP 标记的γ干扰素(IFN- γ)抗体结合, 形成抗体- 抗原- 酶标抗体复合物, 经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色, 并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的γ干扰素(IFN- γ) 呈正相关。用酶标仪在 450n m 波长下测定吸光度( OD 值), 通过标准曲线计算样品中小鼠γ干扰素(IFN- γ) 含量。试剂盒组成: 样本处理及要求: 1. 血清: 室温血液自然凝固 10-20 分钟, 离心 20 分钟左右( 2000-300 0 转/分) 。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。 2. 血浆: 应根据标本的要求选择 EDTA 、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂, 混合 10-20 分钟后, 离心 20 分钟左右( 2000-3000 转/分)。仔细收集上清, 保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。 3. 尿液: 用无菌管收集, 离心 20 分钟左右( 2000-3000 转/分)。仔细收集上清, 保存过程中如有沉淀形成, 应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20分钟左右( 2000-3000 转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用 PBS ( - )稀释细胞悬液,细胞 1 浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。 5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS , 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度。加入一定量的 PBS ( ), 用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取, 提取按相关文献进行, 提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20 ℃保存,但应避免反复冻融. 7. 不能检测含 NaN3 的样品,因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的( HRP ) 活性。操作步骤 1. 标准品的稀释与加样: 在酶标包被板上设标准品孔 10孔, 在第一、第二孔中分别加标准品 100 μl ,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50μl ,混匀; 然后从第一孔、第二孔中各取 100 μl 分别加到第三孔和第四孔, 再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μl ,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 弃掉,再各取 50μl 分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul ,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取 50 μl 分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl, 混匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中, 再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50μl, 混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。(稀释后各孔加样量都为 50μl ,浓度分别为 1200ng/L , 800ng/L , 400ng/L , 200ng/L , 100ng/L )。 2. 加样: 分别设空白孔( 空白对照孔不加样品及酶标试剂, 其余各步操作相同) 、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl ,然后再加待测样品 10μl( 样品最终稀释度为 5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。 3. 温育:用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。 4. 配液:将 30( 48T 的 20倍) 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30( 48T 的20 倍)倍稀释后备用。 5. 洗涤: 小心揭掉封板膜, 弃去液体, 甩干, 每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。 6. 加酶:每孔加入酶标试剂 50μl ,空白孔除外。 7. 温育:操作同 3。 8. 洗涤:操作同 5。 9. 显色: 每孔先加入显色剂 A50 μl, 再加入显色剂 B50 μl, 轻轻震荡混匀, 37℃避光显色 15 分钟. 10. 终止:每孔加终止液 50μl ,终止