Th1-Th2类细胞因子对哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子表达的影响.doc

1 Th1/Th2 类细胞因子对哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子表达的影响作者:代继宏,王永红,何海霞【摘要】目的:初步探讨 IL拟 13和 IFN 拟γ对支气管哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子 NGF 表达的影响. 方法: 建立 Wistar 大鼠哮喘模型, 分离脾淋巴细胞并培养, 通过逆转录拟聚合酶链反应(RT 拟 PCR) 半定量法测定 NGF mRN A 的基础, 12h, 24h 水平, 并观察予以干扰素(IFN 拟γ) 和白细胞介素拟 13(IL 拟 13) 干预后 NGF mRNA : 哮喘大鼠脾淋巴细胞在基础状态下具有表达 NGF mRNA 的功能, 并在 ConA 刺激下呈时间依赖性增强, IL拟 13 组随着干预时间的延长基础 NGF mRNA 表达量逐渐升高, 呈现时间和浓度依赖性, 并且至 12h 后分别高于各时间点的空白对照组(均 ). 而随着 IFN 拟γ干预浓度的依次增高, NGF mRNA 表达相对值却逐渐降低, 也表现出浓度和时间依赖特征. 结论: 在哮喘中 Th2 类细胞因子 IL拟 13可上调淋巴细胞 NGF mRNA 表达, Th1 类细胞因子 IFN 拟γ可下调淋巴细胞 NGF mRNA 表达,两者均呈时间和浓度依赖 2 性; Th1/ Th2 类细胞因子免疫失衡可能通过调控 NGF mRN A 表达间接促进其诱导神经源性气道炎症. 【关键词】哮喘; 神经生长因子; 白细胞介素拟 13; 干扰素Ⅱ型 0 引言哮喘是严重威胁公众健康的疾病, 目前该病的病因、发病机制还不十分清楚, 相关研究已经证实在哮喘发病过程中,T 细胞亚群( 特别是 Th1/Th2) 功能失衡在哮喘发病中有重要作用. 白介素拟 13(IL 拟 13) 和γ拟干扰素(IFN 拟γ)分别是 Th2 和 Th1 效应细胞的细胞因子,在哮喘发病机制中, 两者之间的不平衡是引起免疫球蛋白拟 E(IgE) 产生异常和哮喘发病的重要因素,即 Th2 细胞占优势的反应导致一系列由 IgE 介导的变应性炎症[ 1]. 然而,在 Th1/Th2 失衡中占主导作用的免疫细胞与神经元的相互作用机制仍不清楚. 神经生长因子(nerve growth factor , NGF) 是神经营养因子家族中的成员之一, 其主要功能是调控神经元的生长与分化. 研究表明, NGF 作为神经可塑性调控因子, 通过诱导 3 神经源性炎症反应参与哮喘发病[2]. 我们通过建立大鼠哮喘模型, 探讨大鼠体内 Th1/Th2 材料和方法 只雄性 Wista r 大鼠由重庆医科大学实验动物中心提供, 鼠龄 4~6 wk , 体质量 120 ~ 200 g, 饲养 1 wk 后建立大鼠哮喘模型. 大鼠 IL拟 13和 IFN 拟γ( 上海生工生物工程技术服务有限公司合成); Ficoll 拟 Hypaque 分层液及刀豆素(ConA) 购于美国 Sigm a 公司;总 RN A 抽提试剂盒购于华美生物工程有限公司;逆转录试剂盒购于 Promega 公司; Taq 酶购于 TaKaRa 公司; Trizol 试剂购于美国 Molecular Research Center ; NGF 的 ELISA 试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司. PE4500 PC R 热循环仪系美国 Sigm a 公司出品; Avant 30 低温高速离心机和 Du 拟 70 全自动紫外分光光度计系美国 Beckman 公司出品. 方法 哮喘模型的建立每只大鼠腹腔内注射抗原液 1mL( 其中含鸡卵蛋白 100 mg , 灭活百日咳杆菌疫菌 5× 109 个和氢氧 4 化铝干粉 100 mg) 致敏, 2 wk 后开始用超声雾化器每日给予 10 g/L 鸡卵蛋白雾化吸入 60 min 激发哮喘, 观察症状,连续 2 wk ,建立哮喘模型[ 3]. 取肺组织行病理检测. 细胞分离、培养及干预 脾淋巴细胞分离以颈椎脱臼法处死大鼠, 放入盛 75 mL/L 乙醇的烧杯中浸泡 2~3 min 后置超净工作台上,用无菌眼科剪和眼科组织弯钳取脾,并置于盛有冷 D拟 Hanks 液(10 mL) 培养皿中的筛网上, 剪成 2~3段,用2 mL 注射针芯捻碎. 将细胞悬液移入 10 mL 离心管中,离心(1500 r/min ×5 min) ,弃上清后加入 6 mL Tris 拟 NHCl 破坏红细胞,用吸管吹打混匀后室温下放置 5 min ,离心(1500 r/min ×5 min) ,弃上清,D拟 Hanks 液重悬细胞;取5 mL Fieoll 拟 Hypaque 分层液( 比重为 1.