多药耐药相关蛋白在人肝细胞癌亚群细胞中的表达及意义.doc

多药耐药相关蛋白在人肝细胞癌亚群细胞中的表达及意义
　　【摘要】目的检测肝细胞癌异质性亚群细胞对化疗药物的耐药差异，讨论耐药蛋白在肝癌组织中不同亚群细胞的表达意义。方法①通过TT法分别测定人肝细胞癌异质性亚群细胞在不同浓度、不同化疗药物〔对这两种亚群细胞生长的抑制程度及多耐药基因在两种亚群细胞中的表达程度，来讨论H组织中DR基因表达与肿瘤的生物学特性和患者预后之间的关系，为临床预测化疗疗效、指导合理用药提供理论根据。
　　1材料与方法
　　
　　LS-1和LS-2亚群细胞：取材于同1例原发性肝细胞癌手术标本组织，通过原代细胞培养，采用有限稀释法克隆别离出经鉴定具有不同形态和生物学特征的两种细胞亚群，并且两种亚群细胞的致瘤性也不一样［4］。主要试剂：DE、胎牛血清〔FBS〕、谷氨酰***、青霉素、链霉素为美国Gib公司产品；胰蛋白酶为Siga公司产品；TT、小鼠抗DR1抗体、小鼠抗RP抗体、小鼠抗LRP抗体、小鼠抗GST抗体、FIT标记兔抗小鼠IgG抗体为北京中山公司产品。
　　
　　
　　人肝细胞癌LS-1、LS-2亚群细胞置于温度为37℃含5%2气体的培养箱中，选用含10%胎牛血清的DE培养基，常规培养两种亚群细胞。
　　
　　：用不含血清的DE培养基倍比稀释化疗药物阿霉素〔AD〕、顺铂〔DDP〕、足叶乙甙(VP-16)3种药物，参照各药临床用量的血峰浓度，以每种单药的不同浓度分组，分别参加，终浓度为：、、、、，、、1、10、100μg/l，VP-、、10、100、200μg/l，上述药物每种浓度设3个复孔。同时设3个复孔不加药作为阴性对照。
　　：人肝细胞癌LS-1、LS-1亚群细胞，以每孔100μl细胞悬液〔含有1×105细胞〕接种于96孔培养板，贴壁24h后更换培养液。按实验分组分别处理细胞。加药组:肿瘤细胞悬液100μL/孔，抗癌药10μL/孔，培养液90μl/孔。阴性对照组不加抗癌药，肿瘤细胞悬液100μL/孔，培养液100μL/孔；空白对照组只加培养液〔200μL/孔〕。24h后更换为不含抗生素的培养液，参加TT〔5g/l〕20μl，继续培养4h。翻板法弃上清液，(DS)，将培养板在微量振荡器上振荡5in，酶标仪上以570n波长测各孔的吸光光度值(A)。按公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=(1－实验组A值/空白对照组值)×100%。利用I50计算软件分析药物作用LS-1、LS-2细胞后半数抑制浓度I50。
　　
　　〔1〕细胞培养：分别取对数生长期的LS-1、LS-2亚群细胞，%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，调整浓度为1×107/l。(2)实验取100μl的细胞悬液分别参加5l的EP管中，每亚群细胞各种耐药蛋白检测设3个复管，每亚群细胞设立1同型对照；每管参加100μlReagentA(固定液)，轻轻振荡使细胞处于单细胞状态，室温孵育30in。(3)参加3l的PBS〔%NaN3和5%